EasyAmplicon 2：扩展了PacBio和Nanopore长扩增子测序分析流程，适用于微生物组研究

《Advanced Science》：EasyAmplicon 2: Expanding PacBio and Nanopore Long Amplicon Sequencing Analysis Pipeline for Microbiome

三代测序技术（如PacBio和Nanopore）在微生物分类中的应用显著提升了物种级分辨率，但缺乏易用、可重复的完整分析流程。EasyAmplicon 2通过整合DADA2、Emu等工具，构建了从原始数据到高质出版图的全流程分析框架，支持多平台数据（Illumina/PacBio/Nanopore），并优化了可视化模块。研究验证其物种注释准确率（PacBio达99.07%）显著优于其他工具，且支持交互式报告和第三方工具兼容，为微生物生态研究提供高效解决方案。

　　在过去的十年中，第三代测序技术（如PacBio和Nanopore）逐渐成熟并广泛应用于微生物分类和定量分析。与Illumina测序技术相比，这些技术具有读长更长和分类分辨率更高的优势。然而，目前仍然缺乏一个易于使用、可重复且由社区支持的分析流程，专门用于处理PacBio和Nanopore扩增子测序数据。为了解决这一问题，一款备受关注的工具EasyAmplicon更新至版本2，该版本全面支持第三代全长扩增子数据的分析。EasyAmplicon 2是一个用户友好的分析流程，不仅适用于来自不同测序技术（如Illumina、BGI、PacBio、Nanopore或Qitan）获得的数据，还集成了诸如DADA2和Emu等流行工具，提供从原始数据到可用于发表的可视化结果的完整工作流程。EasyAmplicon 2继承了前一版本的优点，并进一步优化了可视化部分，使研究人员能够更加高效地处理和分析长读长扩增子测序数据。

扩增子测序技术长期以来是微生物群落研究的重要组成部分，使研究人员能够通过靶向扩增保守基因标记区域（如16S/18S rRNA、ITS等）来表征微生物群落的分类和生态多样性。在过去十多年里，传统的短读长测序平台如Illumina主导了这一领域，通过靶向扩增部分基因区域，提供了可靠但常常碎片化的微生物多样性信息。然而，短读长扩增子通常只能覆盖基因的高变区，这在一定程度上限制了物种级别的分类精度和系统发育重建的可靠性。随着第三代长读长测序技术的出现，研究人员现在可以获取覆盖整个基因的全长扩增子序列，如约1.5 kb的细菌16S rRNA基因或多基因靶标。这些长读长序列提供了前所未有的分类分辨率，使得物种级别的分类、更精确的系统发育分析以及微生物群落功能解读成为可能。尽管早期的长读长测序技术存在较高的单次读取错误率，但随着技术的不断进步，序列准确率已提升至超过97%。随着第三代测序技术的持续优化和发展，这些技术的局限性如高错误率预计将逐步被克服，其广泛应用的时代即将到来。

然而，长读长扩增子数据的分析也带来了新的挑战。例如，这些数据与传统短读长分析流程的兼容性较差，且缺乏标准化的端到端工作流程，用于将原始数据转化为高质量、可发表的输出。为了解决这些问题，我们提出了EasyAmplicon 2，一个专为长读长扩增子测序设计的流程。该版本基于前一版本EasyAmplicon 1.0进行优化和增强，不仅适用于短读长数据，还支持PacBio和Nanopore等长读长数据集。EasyAmplicon 2采用模块化设计，结合Shell脚本和R语言，实现了从原始数据处理到特征表分析和可视化的一站式解决方案。该流程支持多种测序技术，并整合了如NanoFilt、Cutadapt和Emu等关键软件，从而实现了从质量控制到分类注释的完整分析链。此外，它还提供了超过30种可定制的可视化样式，适用于生态解释和论文发表。

EasyAmplicon 2在多个方面进行了显著改进。首先，它提供了对长读长扩增子数据的全面支持，而不仅仅是短读长数据。其次，该流程采用Snakemake构建的自动化工作流，提高了任务调度、依赖追踪和并行执行的效率，从而增强了流程的可移植性和可重复性。此外，EasyAmplicon 2支持多种主流分类数据库（如SILVA、GTDB、NCBI、Emu默认数据库、UNITE、Greengenes和RDP），并优化了不同数据库之间的格式转换，提高了分类注释的灵活性和兼容性。为了提高用户的使用效率，该流程还提供了详细的使用说明和逐步解释，确保即使是非专业人员也能轻松上手。此外，EasyAmplicon 2在GitHub上免费提供，便于研究人员访问和使用。

在实验部分，我们详细描述了EasyAmplicon 2的实现和架构。该流程采用模块化设计，结合Shell脚本处理核心任务，R语言用于统计分析和可视化。这种双语言设计确保了大规模数据处理的计算效率，同时为高级统计分析提供了灵活性。EasyAmplicon 2支持两种运行模式：一种是通过命令行界面批量处理大规模数据集，另一种是通过交互式RStudio界面进行探索性分析和可视化。此外，我们还使用Snakemake工作流管理系统构建了自动化版本，进一步提高了流程的可移植性和可重复性。该流程已在Windows（通过Git Bash）、macOS和Linux系统上验证了跨平台兼容性。

在数据处理方面，EasyAmplicon 2采用了优化的质量控制流程，包括配对端数据的读取合并、基于Q值的过滤（Q值≥20）以及针对不同测序技术的适配器去除。对于长读长数据，流程采用了一种混合的错误校正方法，结合PacBio的循环共识测序（CCS）技术和Nanopore的信号级校正方法。序列去重和嵌合体去除基于SILVA 138.2数据库进行。此外，流程还采用了优化的DADA2算法，结合平台特定的参数设置，实现对长读长数据的去噪处理。同时，传统基于97%相似度的OTU聚类方法仍可用于基于OTU的分析。

在分类和系统发育分析方面，EasyAmplicon 2提供了三种不同的分类方法：1）使用VSEARCH中的SINTAX算法进行快速参考分类；2）通过DADA2进行去噪并生成ASV（扩增子序列变体），随后使用参考数据库进行分类；3）采用Emu默认数据库及其内置分类器，同时对数据库格式进行了优化，以确保不同流程之间的兼容性。这些方法可以独立使用或组合使用，具体取决于分析需求。系统发育重建采用最大似然（ML）方法，并通过自举支持（bootstrap）评估分支的可靠性。

为了验证EasyAmplicon 2的性能，我们使用了模拟数据集进行比较分析。模拟数据集来源于之前发表的研究，用于评估EasyAmplicon 2与版本1.0的性能差异。同时，我们还将其与现有的第三代扩增子分析流程（如TRANA、Hifi-16S-workflow、ampliseq和NanoCLUST）进行了比较，评估了不同流程在分类准确性方面的表现。结果显示，EasyAmplicon 2在微生物物种分类方面具有更高的准确性，这主要归功于其整合了最新的软件和数据库，提供了更精确和用户友好的解决方案。

在统计分析方面，所有数据均使用R软件（版本4.3）进行处理。分析框架包括全面的多样性评估，涵盖了α多样性指标（如Shannon、Simpson、Chao1）和β多样性指标（如加权/非加权UniFrac和Bray-Curtis相似性）。不同组之间的α多样性差异通过双尾Wilcoxon秩和检验进行评估，而β多样性差异则通过PERMANOVA（置换多元方差分析）进行检测。差异丰度分析使用LEfSe（线性判别分析效应大小）方法进行，具体步骤包括使用非参数Kruskal-Wallis秩和检验检测不同组间物种的丰度差异，随后使用Wilcoxon秩和检验进一步评估亚组间的一致性。此外，LDA（线性判别分析）用于评估每个特征的效应大小。生物标志物识别则采用随机森林分类方法。共现网络分析使用ggClusterNet 2进行，而功能预测则采用PICRUSt2完成。MaAsLin 2用于检测不同组间功能丰度的差异，所有定量数据均以均值±标准误（mean ± SEM）的形式呈现，且p值小于0.05被视为统计显著。

在讨论部分，我们强调了第三代长读长测序技术在微生物生态学研究中的重要性。这些技术能够提供完整的16S rRNA基因覆盖，从而显著提高物种级别的分类精度。然而，由于其较高的原始错误率和通常较低的测序深度，长读长测序在低丰度微生物的检测方面仍存在挑战。因此，采用计算流程（如结合CCS和DADA2）进行错误校正变得尤为重要。尽管已有研究证明长读长测序平台在物种分类方面具有优势，但短读长测序在稳定丰度估计和低丰度微生物检测方面仍具优势。不同测序技术在属级丰度上的差异可能源于读长、测序精度、引物偏差、数据库覆盖范围、分类方法以及后续的标准化或过滤步骤。在本研究中，使用模拟数据和相同的分类方法，我们观察到了短读长与长读长序列在属级丰度上的差异，这可能反映了不同测序技术在读长、测序精度或引物偏差方面的差异。我们建议在微生物扩增子研究中优先使用第三代测序技术，因为它提供了显著提高的物种分类精度。EasyAmplicon 2的开发进一步确认了长读长数据在物种分类方面的优势，并通过整合最新的软件和数据库，实现了更准确的分析。

此外，我们还讨论了EasyAmplicon 2在未来的潜在发展方向。未来的工作将集中在三个方面：1）对现有长读长扩增子分析软件进行基准测试，以进一步优化流程；2）提高处理超深测序数据集（如超过1000万条读取）的计算效率；3）扩展功能，增加对更多类型标记基因的支持，并添加更多适用于长读长扩增子数据的分析和可视化选项。此外，云平台部署方案也在开发中，以支持大规模协作研究，并计划开发一个在线分析平台，供缺乏编程经验的用户使用，从而进一步提高工具的可访问性。

在结论部分，我们总结了EasyAmplicon 2的优势和适用性。该流程为从长读长测序平台获取的全长扩增子数据提供了强大、全面且易于使用的分析解决方案。EasyAmplicon 2具有高运行效率，并支持多种平台（如Illumina、PacBio或Nanopore）的数据，涵盖了质量控制、去噪、分类注释、多样性分析、生物标志物检测和功能预测等多个方面。通过支持主要分类数据库并提供无缝的可视化选项，EasyAmplicon 2使研究人员能够深入揭示微生物群落的生态模式和功能机制。随着全长测序技术在微生物生态学、临床微生物学、农业和环境科学等领域的应用不断扩展，EasyAmplicon 2正成为高分辨率扩增子分析的重要工具，为复杂微生物群落的结构和功能研究提供了新的可能性。