小鼠实验性哮喘中胶原蛋白、蛋白酶及其抑制剂以及细胞死亡的动态调控

《Allergy》：Dynamic Regulation of Collagens, Proteases, Their Inhibitors, and Cell Death in Experimental Asthma in Mice

本研究通过家尘螨提取物诱导的急性T2-low和慢性Th17介导哮喘模型，揭示了气道重塑的免疫和结构变化差异。急性模型显示 goblet细胞增生、胶原沉积及ECM重塑增强，而慢性模型呈现MMP活性升高和ECM降解，伴随坏死性细胞死亡。研究强调了不同炎症表型下ECM调节失衡和细胞死亡机制的关键作用，为靶向治疗提供了新思路。

　　哮喘是一种复杂的气道疾病，其发病机制涉及多种免疫反应路径。尽管类型2（T2）介导的炎症机制已经被广泛研究，但T2低（也称为混合性炎症表型）或非T2介导的哮喘机制仍不明确。这类哮喘通常与Th1/Th17驱动的免疫反应及肺部中性粒细胞炎症相关，但其具体过程和病理特征尚未完全阐明。本研究通过使用尘螨提取物（HDM）诱导的急性与慢性哮喘模型，深入探讨了气道重塑的机制，揭示了不同表型哮喘在炎症和结构变化方面的差异。研究结果不仅有助于理解哮喘的复杂性，还为开发新的治疗策略提供了科学依据。

### 气道重塑与哮喘的病理特征

哮喘的病理特征包括气道炎症、可变气流阻塞以及气道高反应性，这些特征常受到遗传、环境及免疫因素的影响。然而，近年来的研究表明，表观遗传机制在哮喘的发展和变异性中也起着重要作用。表观遗传调控能够影响免疫细胞和结构细胞的反应，从而在哮喘的发病机制中发挥关键作用。传统的哮喘研究主要关注T2型炎症，而忽视了其异质性或与其他免疫路径的相互作用。事实上，大约有一半的哮喘患者表现出T2型炎症，这种炎症由Th2细胞、类型2固有淋巴样细胞、嗜酸性粒细胞及其主要细胞因子如IL-4、IL-5和IL-13驱动。这类哮喘通常对皮质类固醇和新型生物制剂有良好的反应。然而，轻度至重度皮质类固醇不敏感的哮喘患者往往属于非T2或T2低表型，其特征是Th1/Th17细胞介导的免疫反应、中性粒细胞数量增加以及以IL-17A和IL-17F为主的细胞因子。此外，这些表型还常伴随其他共病，如肥胖、吸烟相关气道疾病、慢性鼻窦炎无息肉、胃食管反流病、心理障碍等，进一步增加了其治疗难度。

值得注意的是，非T2和T2低表型的哮喘患者对标准疗法的反应较差，包括新型生物治疗，这构成了重要的治疗挑战。这些表型往往导致频繁的严重发作，甚至需要住院治疗，并且增加了其他共病的风险。因此，深入了解这些不同哮喘表型中免疫细胞与结构细胞之间的复杂相互作用，对于开发新的治疗策略至关重要。

### 气道重塑与肺纤维化的机制

气道重塑和纤维化是未控制或控制不佳哮喘的常见表现，其特征包括：（i）由于胶原蛋白等成分的增加沉积，导致基底膜外基质（ECM）增厚；（ii）杯状细胞增生和黏液过度分泌；（iii）平滑肌肥大和/或增生；以及（iv）血管生成增强。目前的哮喘治疗主要集中在控制气道炎症和症状，但对气道重塑和纤维化的直接干预仍然有限。尽管一些研究显示，使用吸入型皮质类固醇或生物制剂可能部分缓解气道重塑，但这些疗法并未专门针对结构变化。因此，完全预防或逆转气道重塑和纤维化仍然是哮喘治疗中的重大挑战。

为了更好地理解不同哮喘表型中气道重塑和纤维化的机制，本研究使用了尘螨提取物诱导的实验性哮喘模型。这些模型能够反映急性T2低型气道炎症（AAI）和慢性非T2型炎症。研究发现，急性模型表现出显著的气道炎症，包括杯状细胞增生、胶原沉积以及ECM重塑和成纤维细胞激活的显著上调。而慢性Th17型模型则表现出ECM沉积减少、基质金属蛋白酶（MMP）活性增加以及由IL-17A驱动的分子特征，这表明ECM降解和结构不稳定。此外，急性模型中主要的细胞死亡机制是免疫细胞凋亡，而慢性炎症模型则以结构肺细胞的坏死性凋亡（necroptosis）为特征，这种机制可能促进持续的炎症和重塑。

### 实验设计与方法

本研究使用C57BL/6小鼠，通过鼻腔给予不同剂量的尘螨提取物（HDM）来诱导急性混合型（2周，10或100 μg HDM）和慢性中性粒细胞型（12周，100 μg HDM）气道炎症。对照组小鼠则接受生理盐水。在最后一次刺激后48小时，收集肺组织进行组织学评估、全肺转录组分析（RNA-seq）和蛋白分析。此外，使用流式细胞术、多重免疫分析、Western blot分析、免疫组织化学和共聚焦显微镜评估炎症和结构变化。研究中还详细描述了所用方法、抗体列表和分析流程。

### 急性与慢性哮喘模型的差异

在研究中，我们使用了三种不同的小鼠模型来分析哮喘相关的气道重塑。其中，两种急性模型表现出不同的HDM剂量，而慢性模型则延长了刺激时间。结果显示，急性模型中，HDM 100诱导的炎症反应更为显著，表现为更多的白细胞浸润、上皮细胞脱落、杯状细胞增生和黏液过度分泌，以及胶原蛋白沉积增加。然而，在慢性模型中，由于中性粒细胞的大量浸润，导致ECM沉积的观察受限，因此需要其他方法进行评估。

通过转录组分析，我们发现急性模型中存在大量与ECM重塑相关的基因表达变化，而慢性模型则表现出不同的调控模式。例如，胶原蛋白基因在急性模型中显著上调，而在慢性模型中则呈现下调趋势。此外，研究还发现，在慢性模型中，MMPs的表达增加，而TIMPs的表达减少，这种失衡可能加剧ECM的降解和结构不稳定。同时，急性模型中观察到较高的凋亡水平，而慢性模型中则以坏死性凋亡为主。

### 胶原蛋白亚型的表达差异

研究进一步分析了不同哮喘模型中胶原蛋白亚型的表达情况。结果显示，急性模型中，胶原蛋白I、III和IV的表达显著增加，而慢性模型中则表现出不同的模式。胶原蛋白VI和VIII的表达在急性模型中显著增加，而在慢性模型中则减少。这些变化可能与气道重塑和纤维化的机制密切相关。胶原蛋白VI在维持肺组织结构和调节纤维反应中起着关键作用，而胶原蛋白VIII则支持血管和肺泡的稳态，有助于气体交换和修复。

### MMPs与TIMPs的表达变化

MMPs和TIMPs的表达变化在不同哮喘模型中表现出显著差异。研究发现，MMP2、MMP8、MMP9和MMP12在急性模型中显著上调，而TIMPs的表达则呈现下调趋势。这种失衡可能促进ECM的降解，导致结构破坏。此外，在慢性模型中，MMP8和MMP9的表达显著增加，而TIMP3和TIMP2的表达减少，进一步加剧了ECM的破坏。这些结果表明，MMPs和TIMPs的失衡在不同哮喘表型中可能发挥不同的作用，从而影响气道重塑和纤维化的进程。

### 细胞死亡机制的差异

在急性模型中，观察到较高的凋亡水平，特别是在肺泡区域。而慢性模型中，凋亡减少，取而代之的是坏死性凋亡（necroptosis）成为主要的细胞死亡机制。坏死性凋亡是一种受RIPK1和RIPK3调控的程序性坏死，可能导致促炎性损伤相关分子模式（DAMPs）的释放，从而加剧炎症反应和组织损伤。此外，研究还发现，在慢性模型中，RIPK1和RIPK3的磷酸化水平显著增加，这可能反映了坏死性凋亡的激活。

### 结论与未来方向

本研究通过比较急性与慢性哮喘模型，揭示了不同表型哮喘在气道重塑和纤维化中的分子和细胞机制。急性模型主要表现出ECM沉积和成纤维细胞激活，而慢性模型则强调MMP介导的ECM降解和细胞死亡机制。这些发现为理解哮喘的异质性提供了新的视角，并强调了开发更先进和代表性的实验模型的必要性，以更深入地研究气道重塑的机制。此外，研究还指出，未来的临床研究应重点验证这些发现，并探索针对哮喘中炎症与气道重塑复杂相互作用的新治疗策略。这将有助于改善当前对非T2和T2低型哮喘的治疗效果，提高患者的生活质量。