中性粒细胞蛋白2-氯脂肪酸修饰的鉴定、定位及其在NETosis中的作用机制研究

《Cell Communication and Signaling》：2-chlorofatty acid modification of neutrophil proteins: identification, localization and role in NETosis

本研究针对髓过氧化物酶(MPO)源性2-氯脂肪酸(2-ClFA)诱导中性粒细胞胞外诱捕网(NET)形成的分子机制展开深入探索。研究人员通过点击化学技术鉴定出127个2-ClFA修饰的中性粒细胞蛋白，包括肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)、中性粒细胞防御素α3(DEFA3)和基质金属蛋白酶8(MMP8)等关键NETosis相关蛋白。研究发现2-ClFA通过激活PAD4并促进其核转位，显著增强组蛋白瓜氨酸化，从而驱动NET形成。该成果为脓毒症等炎症性疾病中NETosis的调控机制提供了新的分子见解。

　　

当病原体入侵人体时，中性粒细胞作为免疫系统的第一道防线，会通过多种机制清除入侵者。其中，中性粒细胞胞外诱捕网(NETosis)是一种特殊的防御方式，中性粒细胞会释放由DNA和抗菌蛋白组成的网状结构来捕获并杀灭病原体。然而，当NETosis过度激活时，这些网状结构也会对宿主组织造成损伤，特别是在脓毒症等严重炎症性疾病中，NETosis被认为与微血管功能障碍和多器官衰竭密切相关。

髓过氧化物酶(MPO)是中性粒细胞产生的一种关键酶，它能将过氧化氢(H₂O₂)和氯离子(Cl^-)转化为次氯酸(HOCl)。HOCl作为一种强氧化剂，能够靶向攻击血浆缩醛磷脂的乙烯醚键，释放出2-氯脂肪醛(2-ClFALD)，后者进一步被氧化生成2-氯脂肪酸(2-ClFA)。前期研究表明，2-ClFA能够诱导NETosis，但其具体分子机制尚不清楚。

在这项发表于《Cell Communication and Signaling》的研究中，Carlson等人深入探讨了2-ClFA通过共价修饰中性粒细胞蛋白来调控NETosis的分子机制。研究人员利用点击化学技术，首次系统性地鉴定了2-ClFA在中性粒细胞中的蛋白靶点，并揭示了这些修饰蛋白在NETosis过程中的动态变化规律。

研究团队采用点击化学类似物2-氯十六碳-15-炔酸(2-ClHyA)结合生物素-叠氮化物标记技术，通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析鉴定了2-ClFA修饰的蛋白质组。利用免疫荧光技术追踪了2-ClFA修饰蛋白与关键NETosis调节因子在时空上的共定位关系，并通过酶活性测定评估了2-ClFA对PAD4和MMP8功能的调控作用。所有实验均使用从健康志愿者外周血分离的原代人中性粒细胞。

蛋白质靶点鉴定结果

通过比较2-ClHyA和十六碳炔酸(HyA)的修饰谱，研究团队鉴定出127个被2-ClFA特异性修饰的中性粒细胞蛋白。生物信息学分析显示，这些蛋白主要富集在代谢物互变酶类和蛋白结合活性调节剂类。值得注意的是，三个与NETosis密切相关的关键蛋白——肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)、中性粒细胞防御素α3(DEFA3)和中性粒细胞胶原酶(MMP8)均被鉴定为2-ClFA的修饰靶点。

2-ClHyA诱导NETosis的验证

研究人员证实2-ClHyA与2-ClHA类似，能够以浓度和时间依赖的方式诱导NETosis。通过Sytox Green检测细胞外DNA(ecDNA)释放，发现2-ClHyA在120分钟内显著促进NET形成。免疫荧光图像显示，MPO与2-ClHyA修饰的蛋白在NETs的DNA链上共定位，表明2-ClHyA诱导的是自杀性NETosis。

2-ClHyA修饰蛋白的时空定位

时间进程实验揭示了2-ClFA修饰蛋白在NETosis过程中的动态变化。在刺激初期(30秒)，2-ClHyA与DEFA3在嗜天青颗粒中显著共定位(Pearson R=0.88)。随着NETosis进展(30分钟)，两者分布变得弥散，并开始向核内转移。在NETs形成阶段(120分钟)，2-ClHyA和DEFA3共同装饰在DNA网络上。

PAD4的修饰与激活

研究发现PAD4是2-ClFA的重要修饰靶点。在NETosis初期，PAD4与2-ClHyA均呈现核周分布(Pearson R=0.91)。随着过程推进，两者共同向核内转移，并在组蛋白去浓缩阶段保持密切共定位。重要的是，2-ClHA能够显著增强PAD4的酶活性，而同等浓度的HA则无此效应，表明2-ClFA对PAD4的激活具有特异性。

MMP-8的修饰与功能调控

Western blot证实MMP-8可被2-ClHyA和HyA共同修饰。功能实验显示2-ClHA和2-ClHyA均能增强MMP-8的酶活性，提示2-ClFA修饰可能通过变构效应调节MMP-8的功能。

本研究系统阐明了2-ClFA通过共价修饰中性粒细胞蛋白调控NETosis的分子机制。研究发现2-ClFA修饰包括PAD4、DEFA3和MMP8在内的127个中性粒细胞蛋白，其中对PAD4的修饰和激活尤为关键。2-ClFA促进PAD4核转位，增强其组蛋白瓜氨酸化活性，从而驱动染色质解聚和NET释放。在脓毒症等病理状态下，2-ClFA水平升高可能通过这一机制加剧NETosis相关的组织损伤。该研究不仅揭示了MPO-HOCl-2-ClFA信号轴在NETosis中的核心作用，还为开发针对NETosis相关疾病的治疗策略提供了新的分子靶点。