体外癌症相关成纤维细胞异质性模型揭示了CRISPR干预对不同亚型的特异性影响

《Molecular Oncology》：In vitro models of cancer-associated fibroblast heterogeneity uncover subtype-specific effects of CRISPR perturbations

研究建立了基于患者来源的CAFs与肿瘤细胞体外共培养模型，结合单细胞转录组测序和Perturb-seq技术，系统解析了胰腺癌中CAFs的亚型异质性及其与免疫抵抗的关联。通过scRNA-seq发现，共培养模型可诱导出myCAF、ecmCAF、ifnCAF等多种临床亚型，并揭示其塑性转换的分子机制，包括TGFBR1介导的ECM重塑与免疫抑制。Perturb-seq实验显示，靶向TGFBR1、SPATS2L等基因可显著改变CAFs亚型分布及功能，如TGFBR1抑制促进ECM降解和免疫激活，SPATS2L抑制增强ECM稳定性。研究证实体外模型能保留临床亚型特征，为CAFs靶向治疗提供了可扩展的模型和潜在靶点。

　　癌症相关成纤维细胞（CAFs）因其在肿瘤发展中的双重作用——促肿瘤和抗肿瘤——被认为是潜在的治疗靶点。这些细胞的异质性源于不同亚型的特化功能，因此，要设计能够有效调控CAFs表型的疗法，必须深入理解这些亚型的特性，并开发具有临床转化潜力的模型系统。然而，目前我们对CAFs在实体瘤中的异质性了解有限，特别是在胰腺肿瘤中，且CAFs模型的转化能力尚未得到充分验证。本研究通过建立一种使用原发性CAFs与永生化肿瘤细胞系共培养的模型，成功再现了CAFs在肿瘤中的表型特征，并探讨了干扰潜在基质基因对不同CAFs亚型的影响。

CAFs在肿瘤微环境（TME）中扮演着关键角色，它们通过多种信号通路和与免疫系统的交互影响肿瘤生物学。在某些恶性肿瘤中，如胰腺导管腺癌（PDAC），CAFs可能占据肿瘤的主要部分。值得注意的是，CAFs不仅与治疗效果相关，还可能赋予肿瘤对免疫治疗的抵抗性。因此，CAFs的靶向调控已成为癌症治疗的一个重要策略，催生了许多临床试验，旨在减少CAFs的激活、调节其活性或将其逆转为正常成纤维细胞。

为了更深入地研究CAFs的异质性，我们采用了单细胞技术，如单细胞RNA测序（scRNA-seq）和CRISPR介导的基因干扰（Perturb-seq）。这些技术能够揭示CAFs亚型之间的特异性变化，并帮助我们理解不同基质靶点对CAFs表型的影响。在本研究中，我们从四名胰腺肿瘤患者中分离出CAFs，并通过与PDAC细胞系BxPC3共培养或使用TGFβ1进行处理，创建了激活的CAFs模型。随后，我们利用scRNA-seq分析了这些细胞系的表型多样性、其在永生化模型中的保持情况、可塑性轨迹以及免疫抵抗表型的再现情况。

我们的研究发现，通过共培养CAFs与肿瘤细胞系，可以有效地产生在临床中观察到的CAFs亚型多样性，即使原始CAFs样本在基线状态下缺乏某些表型。同时，我们验证了CAFs与肿瘤细胞共培养模型在促进肿瘤生长、增强细胞因子和细胞外基质（ECM）生成以及增加细胞收缩力方面的相关性。此外，我们还使用永生化的CAFs细胞系进行Perturb-seq实验，以研究干扰新型基质靶点所引发的机制变化和亚型特异性影响，从而为设计潜在的CAFs调控策略提供了重要依据。

在实验方法方面，我们首先从人类肿瘤组织中分离CAFs，并通过特定的培养条件进行激活和永生化处理。为了确保实验的准确性，我们进行了严格的细胞系认证，包括检测支原体污染和确认细胞来源。随后，我们利用单细胞技术进行测序，包括单细胞RNA测序和CRISPR介导的基因扰动实验。通过这些方法，我们能够生成高质量的测序数据，并进行后续的分析处理。

在数据处理过程中，我们使用了10X Genomics的Cell Ranger软件对scRNA-seq和Perturb-seq数据进行预处理。我们首先对测序数据进行去复用和生成基因表达矩阵，然后对数据进行标准化处理，并去除批次效应。随后，我们使用Seurat进行单细胞数据分析，包括质量控制、数据归一化、集群整合以及Louvain社区检测。我们还利用mixscape方法区分成功扰动的细胞（KO）和未被扰动的细胞（NP），并进行后续的分析。

在分析结果时，我们发现不同CAFs亚型在不同的实验条件下表现出显著的差异。例如，通过共培养产生的iCAFs表现出高表达的细胞因子和趋化因子，而TGFβ1处理则主要促进了ECM相关的基因表达。我们还利用轨迹分析方法，揭示了CAFs亚型之间的可塑性。通过构建最小生成树（MST）并计算伪时间，我们能够识别与不同轨迹相关的差异表达基因（DEGs），并分析这些基因在不同亚型中的作用。

在扰动实验中，我们对多个基因进行了干扰，包括TGFBR1、AEBP1、SPATS2L和PTGS1。这些基因的选择基于其在CAFs中的新特性、表达上调以及与CAFs生物学的关联。我们发现，干扰这些基因会导致不同的信号通路变化，例如TGFBR1干扰会增强IFN活性并抑制ECM代谢，而SPATS2L干扰则会促进ECM蛋白聚糖的上调。这些结果表明，通过干扰特定基因可以调控CAFs的表型，从而影响肿瘤的发展。

我们的研究还探讨了CAFs在不同肿瘤类型中的功能差异。例如，在PDAC中，CAFs的某些亚型与免疫抵抗相关，而其他亚型则可能具有免疫保护或免疫调节功能。此外，我们还发现，CAFs在不同实验条件下表现出的表型变化可能受到多种因素的影响，包括细胞来源、培养条件和基因干扰的类型。这些发现为未来研究提供了重要的线索，即CAFs的异质性可能与肿瘤的生物学特性密切相关。

在讨论部分，我们分析了CAFs在不同肿瘤类型中的可塑性轨迹。这些轨迹与之前在乳腺癌中的发现相似，表明iCAFs可能作为从健康到恶性成纤维细胞的过渡状态。然而，CAFs的异质性也可能受到多种因素的影响，包括细胞来源、培养条件和基因干扰的类型。此外，我们还注意到，某些基因的干扰可能会影响CAFs的代谢状态，例如通过干扰TGFBR1可以逆转CAFs的代谢状态，使其从糖酵解回到氧化磷酸化。

尽管我们的研究取得了一些成果，但也存在一些局限性。例如，我们缺乏关于原始CAFs亚型多样性的信息，因此无法评估这些多样性在培养过程中是否得以保持。此外，我们使用流式细胞术检测了CAFs的某些特征，但未在scRNA-seq数据中观察到iCAFs的聚集。这可能是由于原始CAFs的表型、重复传代、使用的胶原包被培养皿或其他因素所致。不过，我们的研究结果表明，通过共培养CAFs与肿瘤细胞系可以有效产生与临床样本相似的CAFs亚型多样性，从而支持长期的CAFs细胞系模型用于靶点发现研究。

总体而言，本研究展示了使用体外CAFs细胞系和单细胞扰动实验在促进基质靶点发现方面的潜力。同时，我们强调了CAFs异质性的重要性，以及在设计针对CAFs的治疗策略时，需要考虑不同细胞系的特性。这些发现为未来的癌症治疗研究提供了重要的基础，也揭示了CAFs在肿瘤微环境中的复杂作用。