KIAA1429通过m6A-YTHDC1-LRP4-TNFAIP3轴抑制破骨细胞分化并防治骨质疏松症的新机制

《Cellular & Molecular Biology Letters》：KIAA1429-mediated M6A methylation inhibits osteoclast differentiation via stabilizing Lrp4 mRNA and protects against osteoporosis

本研究针对骨质疏松症（OP）中破骨细胞过度活化的关键病理环节，首次揭示了m6A甲基转移酶KIAA1429通过介导Lrp4 mRNA的m6A修饰，招募阅读蛋白YTHDC1增强其稳定性，进而促进LRP4表达并招募TNFAIP3抑制NF-κB通路，最终抑制破骨细胞分化的全新机制。该研究不仅阐明了KIAA1429在骨代谢中的关键作用，还为其作为骨质疏松症潜在治疗靶点提供了理论依据。

　　

骨质疏松症是一种以骨量减少、骨微结构破坏为特征的代谢性骨病，随着全球老龄化进程加速，其发病率呈显著上升趋势。这种"寂静的流行病"不仅导致骨骼脆性增加、骨折风险升高，还造成沉重的社会经济负担。在骨骼系统内部，成骨细胞主导的骨形成与破骨细胞主导的骨吸收始终维持着动态平衡，而骨质疏松的发生正是由于这种平衡被打破，特别是破骨细胞过度活化导致骨吸收超过骨形成。

近年来，表观遗传修饰在骨代谢调控中的作用日益受到关注。N6-甲基腺苷（m⁶A）作为真核生物mRNA中最常见的转录后修饰，通过甲基转移酶（writers）、去甲基化酶（erasers）和阅读蛋白（readers）的动态调控，参与mRNA剪接、稳定性和翻译等关键过程。虽然已有研究表明m⁶A甲基化在骨质疏松中发挥作用，但关于其具体分子机制，特别是在破骨细胞分化中的调控网络，仍有许多未知领域亟待探索。

在这项发表于《Cellular & Molecular Biology Letters》的研究中，Liu Jincheng等研究人员将目光投向了一个相对未被充分探索的m⁶A甲基转移酶——KIAA1429（也称为VIRMA）。作为m⁶A甲基转移酶复合物的结构平台，KIAA1429能够引导m⁶A修饰沉积在特定基因组位置，但其在骨质疏松和破骨细胞分化中的功能尚不明确。研究人员通过整合单细胞测序、批量RNA测序、临床样本分析以及多种体内外实验模型，系统揭示了KIAA1429通过调控下游靶基因LRP4影响破骨细胞分化的全新机制，为骨质疏松的防治提供了新的理论依据和治疗靶点。

本研究主要采用了以下关键技术方法：通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和批量RNA测序（bulk RNA-seq）筛选差异表达基因；利用卵巢切除（OVX）小鼠模型模拟绝经后骨质疏松；采用显微CT（micro-CT）进行骨微结构分析；通过体外破骨细胞分化模型（RAW264.7细胞和原代骨髓源性巨噬细胞BMDM）进行功能验证；使用甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）鉴定m⁶A修饰位点；构建腺相关病毒（AAV）递送系统进行体内基因过表达；采用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除细胞系和小鼠模型；通过RNA免疫共沉淀（RIP）和双荧光素酶报告基因实验验证分子间相互作用。临床研究部分纳入了20例接受髋关节置换术的绝经后女性患者骨组织样本。

KIAA1429和m⁶A修饰在骨质疏松骨组织中降低且与破骨细胞分化密切相关

研究人员首先通过生物信息学分析发现，骨质疏松患者破骨细胞中m⁶A相关基因存在显著差异，其中KIAA1429表达明显下调。建立OVX小鼠模型后，显微CT和组织学分析证实了骨质疏松表型，而单细胞测序进一步显示Kiaa1429在OVX小鼠破骨细胞亚群中表达显著降低。体外实验表明，在RAW264.7细胞和BMDM的破骨细胞分化过程中，Kiaa1429表达水平和总RNA m⁶A含量均随时间推移而下降。临床样本分析同样证实，骨质疏松患者骨组织中KIAA1429 mRNA表达和m⁶A水平显著降低，且与血清CTX-1水平呈负相关，与骨密度T值呈正相关。

KIAA1429调控破骨细胞分化

通过CRISPR/Cas9技术构建Kiaa1429敲除RAW264.7细胞后，研究人员发现KIAA1429缺失导致m⁶A含量降低，破骨细胞相关基因（c-Fos、Ctsk、Mmp9、Nfatc1）表达上调，TRAP和F-actin染色显示破骨细胞分化增强。相反，Kiaa1429过表达则增加m⁶A水平，抑制破骨细胞分化。值得注意的是，KIAA1429敲除对骨髓间充质干细胞（BMMSC）的成骨分化能力没有影响，表明其作用具有细胞类型特异性。

KIAA1429过表达抑制OVX小鼠的骨吸收

体内实验显示，通过AAV递送系统在股骨骨髓腔中过表达Kiaa1429，能够显著改善OVX小鼠的骨微结构参数（Tb.BV/TV、Tb.Th、Tb.No.、BMD），减少骨小梁分离度（Tb.Sp）。组织学染色进一步证实，Kiaa1429过表达可增加骨小梁面积，降低骨吸收活性。从这些小鼠中分离的BMDM也显示出破骨细胞分化能力减弱，验证了该递送系统的有效性。

LRP4被鉴定为KIAA1429介导的m⁶A修饰的下游靶标

为阐明机制，研究人员对Kiaa1429过表达细胞进行了RNA-seq和MeRIP-seq分析。结果显示m⁶A峰主要富集在编码序列（CDS）和3'非翻译区（3'-UTR），其中"GGAC"为保守 motif。通过整合分析，发现239个基因同时存在表达差异和m⁶A修饰变化，GO富集分析提示"肽酰-酪氨酸磷酸化的正调控"通路显著富集。进一步验证发现Lrp4 mRNA水平在Kiaa1429过表达细胞中显著上调，且在破骨细胞分化过程中表达降低。MeRIP-qPCR和MeRIP-seq均证实KIAA1429可增强Lrp4 mRNA的m⁶A修饰，特别是其3'-UTR区域。双荧光素酶报告基因实验进一步验证了KIAA1429通过Lrp4 3'-UTR的m⁶A位点调控其表达。

KIAA1429介导的LRP4抑制破骨细胞分化

恢复实验表明，在Kiaa1429敲除细胞中过表达Lrp4，能够逆转破骨细胞分化的促进作用；而在Kiaa1429过表达细胞中敲除Lrp4，则可解除其对破骨细胞分化的抑制。这些结果证实LRP4是KIAA1429调控破骨细胞分化的下游关键靶点。

KIAA1429介导的LRP4调控体内破骨细胞分化和骨吸收

为进一步验证体内功能，研究人员构建了破骨细胞特异性Lrp4敲除小鼠（Ctsk-CreERT2; Lrp4^fl/fl）。结果显示，在Lrp4缺失的情况下，Kiaa1429过表达无法改善OVX小鼠的骨丢失表型，也无法抑制破骨细胞活性，表明LRP4是KIAA1429发挥骨保护作用不可或缺的下游介质。

KIAA1429通过YTHDC1依赖性机制提高Lrp4 mRNA稳定性

鉴于m⁶A阅读蛋白在识别甲基化修饰中的关键作用，研究人员筛选了可能参与LRP4调控的候选阅读蛋白。发现YTHDC1在Kiaaa1429过表达细胞中显著上调，且RIP实验证实YTHDC1可直接结合Lrp4 mRNA，这种结合在KIAA1429过表达时增强，在敲除时减弱。更重要的是，敲低Ythdc1可逆转KIAA1429过表达对LRP4的上调作用以及对破骨细胞分化的抑制效应，表明YTHDC1是KIAA1429-m⁶A-LRP4轴中的重要阅读蛋白。

KIAA1429介导的LRP4调控破骨细胞中的TNFAIP3

KEGG富集分析提示TNFα信号通路显著富集，其中肿瘤坏死因子α诱导蛋白3（TNFAIP3，又称A20）在Kiaaa1429过表达细胞中明显上调。恢复实验证实，Lrp4过表达可上调Tnfaip3表达，而Lrp4敲除则逆转Kiaaa1429过表达对TNFAIP3的促进作用。免疫共沉淀和免疫荧光实验进一步证实LRP4与TNFAIP3存在直接相互作用，且在破骨细胞分化过程中，两者的共定位明显减少。

KIAA1429/LRP4介导的TNFAIP3通过抑制NF-κB通路活性抑制破骨细胞分化

已知TNFAIP3是NF-κB通路的关键负调控因子，而NF-κB信号在破骨细胞分化中起重要作用。实验发现，Tnfaip3敲除可逆转Lrp4过表达对破骨细胞分化的抑制作用。Western blot和核质分离实验进一步表明，Tnfaip3缺失可恢复Lrp4过表达所抑制的NF-κB通路活化（p-p65、p-IκBα、p-IKKα/β水平）及p65核转位。这些结果证实TNFAIP3是LRP4抑制NF-κB通路和破骨细胞分化的关键下游效应分子。

本研究系统阐明了KIAA1429在骨质疏松症发病机制中的关键作用及分子机制。研究发现，在骨质疏松状态下，破骨细胞中KIAA1429表达降低，导致Lrp4 mRNA的m⁶A修饰减少，使其稳定性下降，LRP4蛋白表达降低。LRP4的减少削弱了其对TNFAIP3的招募能力，从而解除对NF-κB通路的抑制，最终促进破骨细胞分化和骨吸收。相反，通过过表达KIAA1429，可增强YTHDC1介导的Lrp4 mRNA稳定性，上调LRP4表达，招募TNFAIP3抑制NF-κB通路，从而抑制破骨细胞过度活化。

这项研究的创新之处在于首次揭示了KIAA1429-YTHDC1-LRP4-TNFAIP3轴在破骨细胞分化和骨质疏松中的调控作用，不仅深化了对m⁶A甲基化在骨代谢中功能的理解，也为骨质疏松的诊断和治疗提供了新的潜在靶点。特别是KIAA1429作为m⁶A甲基转移酶复合物的支架蛋白，其特异性调控机制可能为开发更具靶向性的表观遗传干预策略提供新思路。然而，研究也存在一定局限性，如临床样本量相对较小，且基于小鼠模型的研究结果向临床转化仍需进一步验证。未来研究可探索KIAA1429表达调控的上游机制，以及LRP4-TNFAIP3相互作用的具体结构基础，为开发小分子调控剂奠定基础。