整合元程序分析揭示多囊卵巢综合征颗粒细胞氧化应激反应转录失调新机制——GPX3的关键调控作用

《Journal of Ovarian Research》：Integrative metaprogram analysis reveals transcriptional dysregulation of oxidative stress response in granulosa cells from polycystic ovary syndrome

本研究通过整合单细胞与批量RNA测序技术，结合元程序分析框架，系统揭示了多囊卵巢综合征(PCOS)颗粒细胞中氧化应激反应通路转录失调的分子机制。研究人员发现谷胱甘肽过氧化物酶3(GPX3)作为关键调控节点，连接代谢与生殖功能障碍，为PCOS的分子病理机制提供了新见解，并为开发靶向治疗策略奠定了理论基础。

　　

多囊卵巢综合征(PCOS)作为影响全球6-20%育龄妇女的常见内分泌代谢疾病，其复杂的病理机制一直是生殖医学领域的重点研究课题。这种综合征以高雄激素血症、排卵障碍、卵巢多囊样改变和胰岛素抵抗为特征，不仅导致生育问题，还增加患者罹患2型糖尿病、心血管疾病和子宫内膜癌的风险。尽管临床意义重大，但PCOS的精确发病机制仍未完全阐明，涉及遗传易感性、表观遗传修饰和环境因素之间的复杂相互作用。

在PCOS的复杂病理生理景观中，氧化应激已成为疾病发生和发展的关键介质。活性氧(ROS)产生与抗氧化防御机制之间的失衡，在PCOS相关的多个组织中创造了氧化损伤状态。既往研究一致报道，与健康对照相比，PCOS患者的卵泡液、颗粒细胞和系统循环中氧化应激标志物升高。这种慢性氧化环境破坏了正常的卵巢类固醇生成、卵泡发生和卵母细胞成熟，同时加剧了外周组织的胰岛素抵抗。由此产生的炎症级联反应进一步延续了氧化失衡，创造了PCOS特征性的自我维持病理循环。

尽管认识到氧化应激在PCOS中的重要性，但几个重大挑战阻碍了对相关分子机制的全面理解。PCOS表型的固有异质性使传统分析方法难以捕捉不同患者亚组中的分子失调谱。以前的转录组学研究提供了有价值但零散的见解，通常检查孤立的细胞群体或批量组织样本，而未考虑细胞复杂性。此外，传统的差异表达分析经常忽视驱动疾病表型的协调表达模式和调控网络。这些方法学限制共同强调了需要更复杂的分析框架，能够整合不同类型的数据以揭示PCOS病理生理中的关键调控节点。

为应对这些挑战，元程序分析提供了一种有前景的计算策略，用于解读细胞相互作用背后的复杂生物系统。与传统通路分析关注预定义基因集不同，元程序捕获基因调控网络的新兴特性，反映多个细胞过程之间的动态相互作用。这种方法能够检测基因表达模式中微妙但具有生物学意义的改变，这些改变可能逃过常规分析。通过识别协调细胞功能和对病理状况反应的协调基因模块，元程序分析可以揭示驱动疾病进展的主调控因子。在PCOS背景下，这种方法对于阐明氧化应激机制如何与激素和代谢失调相交以产生该综合征特征性表现具有特殊价值。

元程序分析的能力可以通过整合互补的转录组学技术得到实质性增强。单细胞RNA测序(scRNA-seq)提供了前所未有的细胞异质性分辨率，能够识别细胞类型特异性对PCOS病理的贡献，并揭示可能在疾病过程中发挥超比例作用的稀有细胞群体。互补地，批量RNA测序提供了更广泛的转录组覆盖范围和检测跨组织细微表达变化的更大统计能力。当这些方法被深思熟虑地整合时，研究人员可以利用scRNA-seq的细胞分辨率，同时保持批量测序的统计稳健性。这种整合对于研究PCOS特别有价值，其中不同的卵巢细胞类型可能对激素失衡和氧化应激表现出不同的反应，共同促成该综合征的复杂表现。

基于这些方法学进展，我们的研究采用整合元程序分析框架研究PCOS发病的分子机制，特别关注氧化应激相关通路。通过结合来自PCOS患者和健康对照颗粒细胞的单细胞和批量RNA测序数据，我们试图识别调控氧化应激反应的关键调控节点。我们的分析特别靶向谷胱甘肽过氧化物酶3(GPX3)，这是一种负责解毒过氧化氢和脂质氢过氧化物的抗氧化酶，先前在代谢疾病中被涉及但在PCOS中研究不足。通过这种全面方法，我们旨在阐明GPX3在PCOS病理生理中的功能意义，并评估其作为诊断生物标志物和治疗靶点的潜力。获得的见解可能有助于开发针对这种常见但复杂内分泌疾病背后氧化应激介导病理的靶向干预措施。

本研究采用整合转录组学方法，结合三个独立数据集：单细胞RNA-seq数据集(GSE240688，包含3例PCOS患者和3例对照的颗粒细胞)、实验室生成的批量RNA-seq数据集(9例PCOS和9例对照)和验证微阵列数据集(GSE34526，含7例PCOS和3例对照样本)。通过非负矩阵分解(NMF)识别颗粒细胞中的转录程序，同时通过差异表达和加权基因共表达网络分析(WGCNA)表征失调基因。采用整合转录组方法在这些互补分析方法交叉点识别关键调控基因。

研究结果揭示颗粒细胞中存在10个不同的转录元程序，其中三个主要亚型通过去卷积分析在193个GTEx卵巢样本中得到验证。元程序4(MP4)在PCOS样本中显著富集，并与氧化应激反应通路相关。差异表达分析在独立患者队列中揭示了199个一致失调的基因。通过整合分析，GPX3被识别为唯一跨越所有三种分析方法的基因。

元程序分析显示PCOS颗粒细胞中的分子特征和细胞异质性。NMF应用于单细胞数据集去卷积转录程序，产生10个稳定元程序(MPs)。分析元程序分布揭示了与疾病状态相关的不同模式。MP1-3和MP8-10在所有样本中稳定表达，表明它们参与独立于疾病状态的基本细胞过程。相比之下，MP4-7表现出PCOS特异性表达模式。基因集富集分析揭示了每个元程序的独特生物学功能。值得注意的是，MP4在与细胞对内源性刺激、含氧化合物、程序性细胞死亡、活性氧、缺氧、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号、转化生长因子-β(TGF-β)信号和Wnt信号通路相关的通路中显示显著富集。这种功能特征强烈暗示MP4参与氧化应激反应和PCOS中已知失调的应激诱导信号级联。

为表征细胞异质性，研究人员使用前30个主成分和0.2的分辨率参数进行无监督聚类，通过t-SNE可视化产生不同细胞簇。所有10个元程序的UCell评分计算揭示了特定元程序与细胞簇之间的显著关联：MP2评分在簇0中显著更高；MP4评分在簇2中升高；MP8主要在簇3中表达。基于这些模式，研究人员将簇0指定为MP2颗粒细胞(GCs)，簇2为MP4 GCs，簇3为MP8 GCs，其余细胞为其他GCs。值得注意的是，MP4 GCs的比例在PCOS样本中显著高于正常对照，表明表达MP4的颗粒细胞扩增可能是PCOS病理生理的特征。

差异表达分析识别PCOS中常见失调基因。PCOS和对照组在年龄、BMI和TSH水平方面成功匹配，无显著差异。正如PCOS病理生理预期，患者表现出显著升高的基础黄体生成素(LH)、睾酮、抗穆勒氏管激素(AMH)水平和窦卵泡计数 compared to controls。在卵巢刺激期间，PCOS患者产生显著更多的卵母细胞和成熟卵母细胞，与其增强的卵泡发育潜力一致。这些发现确认了我们PCOS人群的独特激素和生殖特征，同时验证了我们针对潜在混淆变量匹配策略的有效性。

差异表达分析在两个利用不同转录组平台的独立数据集上进行：实验室生成的批量RNA-seq数据集和公开可用的GSE34526微阵列数据集。为识别不同患者队列中一致失调的基因，研究人员确定了两个数据集DEGs的交集，考虑表达变化方向。这种严格方法产生139个常见上调和60个常见下调基因。常见上调基因的功能富集分析识别了13个KEGG通路和236个GO术语，而常见下调基因在5个KEGG通路和21个GO术语中富集。上调基因显著与细胞应激反应、炎症过程和信号级联相关通路相关。下调基因在代谢通路和细胞稳态过程中富集。这些模式表明PCOS以增强的应激反应机制 coupled with 受损的代谢功能为特征。

WGCNA识别与PCOS相关的共表达模块。为识别与PCOS相关的共表达基因网络，研究人员对实验室生成的数据集进行WGCNA。基于无标度拓扑标准(R²=0.9)和平均连接性分析选择软阈值功率8，确保最佳网络构建同时保留生物学相关性。使用最小模块大小100基因和切割高度0.4的动态树切割，识别19个不同的共表达模块。模块特征基因与PCOS状态之间的相关性分析揭示几个模块的显著关联。其中，蓝色、深青绿色和棕褐色模块与疾病状态表现出最强相关性(相关系数>0.3，P<0.05)。为识别PCOS相关模块内的关键调控基因，研究人员计算了个体基因与模块成员(MM)和PCOS基因显著性(GS)之间的相关性。通过应用MM>0.3和GS>0.3的阈值，识别1,849个与其各自模块和PCOS状态都有强连接的枢纽基因。这些枢纽基因代表PCOS中失调的转录网络的潜在主调控因子。

元程序在批量RNA-seq数据中的验证确认单细胞发现。为验证单细胞衍生元程序在组织水平的相关性，研究人员首先分析它们在单细胞RNA-seq数据中颗粒细胞亚群的分布。元程序组成在不同颗粒细胞簇间变化，在PCOS和正常样本中显示不同的富集模式。

为进一步弥合单细胞和批量转录组分析之间的差距，研究人员采用单样本基因集富集分析(ssGSEA)评分批量RNA-seq样本中的每个元程序。这种方法量化了PCOS和正常队列中每个转录程序的活性。元程序ssGSEA评分的比较分析揭示MP2、MP4、MP5、MP6和MP7活性的显著差异。与单细胞发现一致，MP2在正常样本中表现出更高活性，而MP4、MP5、MP6和MP7在PCOS样本中上调。这些元程序在批量组织样本中的差异活性证实了我们的单细胞发现，并进一步支持这些转录程序在PCOS中的病理相关性。特别是，MP4在单细胞和批量分析中一致上调加强了其作为PCOS病理生理关键驱动因子的潜在作用。

为验证识别的颗粒细胞亚型代表真正的生物实体而非聚类伪影，研究人员对193个GTEx v10卵巢批量RNA-seq样本进行去卷积分析。分析成功检测到跨组织样本的所有三个主要颗粒细胞亚型(MP2、MP4和MP8 GCs)。去卷积结果揭示了跨样本细胞类型比例的一致模式。MP4 GCs在大多数样本中构成主要亚型，通常代表颗粒细胞群体的60-80%。MP8 GCs显示中等丰度(约10-30%)，而MP2 GCs以较低比例(5-15%)一致检测到。这种丰度层次(MP4>MP8>MP2)在大多数样本中非常稳定，仅在个别病例中观察到微小变化。这些细胞亚型在独立批量组织样本中的成功检测，具有可重现的相对丰度模式，提供了强有力的证据，表明我们单细胞定义的元程序对应于有生物学意义的细胞状态而非技术伪影。

整合转录组方法识别PCOS病理生理中的关键调控因子。为识别参与PCOS病理生理的高可信度关键调控因子，研究人员进行整合分析，结合三种互补方法：单细胞分析的MP4特征基因、跨批量数据集的常见差异表达基因和WGCNA模块的枢纽基因。这种严格的多维过滤策略识别GPX3作为唯一一致出现在所有三种分析方法中的基因。这些独立方法的收敛强烈暗示其在PCOS相关转录失调中的核心作用，特别是关于氧化应激反应。

表达分析确认GPX3在PCOS样本中与正常对照相比显著上调 across both the laboratory-generated dataset and the GSE34526 validation dataset。ROC曲线分析证明GPX3在PCOS和正常样本之间的强判别能力 in both the laboratory-generated dataset(AUC=0.802) and the GSE34526 validation dataset(AUC=0.905)，突出其作为PCOS诊断临床相关生物标志物的潜力。GPX3表达在单细胞水平的检查揭示了跨颗粒细胞亚群的特异性分布模式。单基因基因集富集分析识别818个显著富集通路(|标准化富集分数，NES|>1，p.adjust<0.05，q.value<0.2)，其中与葡萄糖代谢、线粒体蛋白降解、胰岛素信号、柠檬酸循环和TCA循环相关的通路突出代表。这些富集模式表明GPX3失调可能影响基本代谢过程和能量稳态，这些在PCOS中已知被扰乱。

多水平GPX3调控网络分析揭示PCOS中的潜在机制。为建立对GPX3在PCOS病理生理中功能相关性的全面理解，研究人员进行整合多水平分析，构建复杂调控网络。基于MP4特征基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络揭示GPX3在一个包含49个蛋白质具有多个功能连接的网络中。在这个网络内，GPX3显示与参与氧化还原稳态和相关细胞过程的几种蛋白质的直接相互作用。

最值得注意的是，GPX3显示与硒蛋白P(SELENOP)的显著连接，硒蛋白P是一种主要的硒转运蛋白，与GPX3在硒依赖性抗氧化系统中协同工作，为谷胱甘肽过氧化物酶活性提供必需的硒辅因子。类似地，谷胱甘肽S-转移酶alpha 1(GSTA1)显示与GPX3的直接相互作用，暗示谷胱甘肽代谢和活性氧解毒中的协调作用。这些相互作用突出GPX3在细胞抗氧化防御机制中的核心位置。

此外，GPX3直接与SLC40A1(铁转运蛋白)相互作用，SLC40A1是一种铁输出蛋白，对于预防铁催化氧化损伤至关重要，连接颗粒细胞中的铁稳态与抗氧化防御。GPX3与THBS1和F3之间的相互作用暗示氧化应激与PCOS相关凝血和炎症通路之间的联系。此外，与细胞外基质蛋白COL1A1和CCN2的关联表明参与氧化应激诱导的基质重塑。与GDNF的连接暗示受PCOS病理生理中氧化状态影响的新神经内分泌调控机制。

我们的miRNA-mRNA相互作用分析识别几个可能调控GPX3表达的microRNA，包括has-miR-4644、hsa-miR-4306和hsa-miR-185-5p，均以高置信度评分预测。通过miRNA-lncRNA关联分析的进一步探索揭示表观遗传调控的复杂层，多个长链非编码RNA(lncRNAs)包括XIST、UCA1、SNHG14、AC073896.4、AT1、NEAT1和AC005082.1可能调节miRNA介导的对GPX3表达的影响。转录因子结合位点分析预测GPX3表达可能受几个关键转录因子调控，这些转录因子涉及卵巢功能，包括SREBF1、H MEF2A、FOXL1和JUND。这暗示PCOS发病机制中GPX3转录失调的多个潜在机制。

此外，药物-基因相互作用查询识别几种可能靶向GPX3相关通路的化合物，包括盐酸多柔比星、脂质体柔红霉素、CL_AMIDINE和化合物14B，为靶向治疗提供潜在途径。总之，这种整合分析将GPX3定位在卵巢功能氧化还原稳态必需的复杂调控网络中，具有可能在PCOS病理生理中被破坏的多层调控。

研究结论与意义方面，这项综合整合转录组研究描绘了多囊卵巢综合征的分子景观，揭示颗粒细胞中的不同转录特征。通过整合单细胞和批量RNA测序方法，研究人员识别疾病特异性元程序，特别是MP4，其在PCOS中显示显著富集并与氧化应激反应通路相关。最值得注意的是，我们的整合分析收敛于GPX3作为连接PCOS病理生理中氧化应激机制和代谢功能障碍的中心调控节点，表现出作为潜在诊断生物标志物的强判别能力。

颗粒细胞中不同转录元程序的识别推进了我们对PCOS发病机制的理解。MP4在PCOS中的富集及其与应激反应通路的关联支持氧化应激作为PCOS关键致病机制的作用。MP4表达颗粒细胞群体的扩增暗示对 heightened oxidative and metabolic stress conditions的适应性反应。这种细胞重编程可能促成受影响患者中观察到的异常卵泡发育和慢性无排卵。MP4在与细胞对内源性刺激、缺氧、MAPK信号和TGF-β信号通路相关通路中的功能富集为PCOS颗粒细胞中已知的表型改变提供了转录框架，包括增强的应激反应和改变的激素反应性。

相反，MP6在正常样本中的优先表达暗示其在维持卵巢稳态中的潜在作用，而其在PCOS中的下调可能代表保护机制的丧失，与PCOS发病机制的"二次打击假说"一致。此外，MP2和MP8在正常卵巢组织中显示不同的表达模式，暗示它们在维持颗粒细胞稳态中的作用，尽管需要进一步研究来表征它们的特定功能。

通过三种独立分析方法的收敛识别GPX3 strongly supports its central regulatory role in PCOS。GPX3作为一种主要的细胞外抗氧化酶，催化过氧化氢和脂质氢过氧化物的还原。其在PCOS颗粒细胞中的显著上调可能代表对抗 increased oxidative stress的补偿机制。

GPX3与胰岛素信号和葡萄糖代谢通路的关联阐明了连接PCOS中氧化应激和代谢功能障碍的机制。胰岛素抵抗影响60-70%的PCOS患者，氧化应激已被牵涉其发病机制。我们的发现表明GPX3上调可能响应胰岛素抵抗诱导的氧化应激而发生，建立影响PCOS代谢和生殖方面的反馈环。

将GPX3定位在与SELENOP和GSTA1直接连接中的网络分析强调其在更广泛抗氧化防御系统内的整合。SELENOP促进硒转运，对于合成含硒代半胱氨酸的蛋白质(包括谷胱甘肽过氧化物酶)至关重要。GSTA1催化还原型谷胱甘肽与各种亲电化合物的结合，从而补充由GPX3执行的解毒功能。多种抗氧化酶的这种协调上调暗示PCOS颗粒细胞中对抗氧化损伤的协同保护反应。我们的整合转录组方法为PCOS病理生理中氧化应激与代谢功能障碍之间的相互联系提供了证据。跨独立数据集参与应激反应和代谢过程的失调基因的识别支持氧化应激与胰岛素抵抗之间的双向相互作用。

GPX3与线粒体蛋白降解和能量代谢通路的关联暗示PCOS发病机制中的线粒体功能障碍。线粒体既是活性氧的产生者又是靶点，线粒体功能障碍已被牵涉胰岛素抵抗和PCOS。

GPX3在区分PCOS与正常样本中的强判别能力，在两个数据集中AUC值超过0.8，突出其作为临床相关生物标志物的潜力。当前PCOS诊断方法依赖于具有显著观察者间变异性的临床、生化和超声检查标准组合。像GPX3这样的分子生物标志物可以增强诊断准确性。超越其诊断潜力，GPX3代表一个有前景的治疗靶点。抗氧化干预在PCOS患者中已显示有益效果，GPX3活性的调节可能提供更靶向的方法。

尽管本研究中采用的稳健多维方法，几个限制值得考虑。研究的横断面性质排除了观察到的分子改变与PCOS发展之间因果关系的确定。跟踪高危个体的纵向研究可以阐明转录变化的时间序列及其与疾病发作和进展的关系。此外，虽然我们使用微阵列数据(GSE34526)的跨平台验证证明了关键发现在不同技术和独立队列中的稳健性，但我们承认微阵列与RNA-seq技术相比的固有限制。使用额外RNA-seq队列的未来验证将提供更全面的转录组覆盖。

虽然我们的研究提供颗粒细胞转录组的全面表征，但PCOS涉及多个组织中的功能障碍。未来研究应整合多组织分析，并通过机制研究调查GPX3的功能意义，以确定GPX3改变代表适应性反应还是对疾病发病机制有因果贡献。

总之，我们的综合整合转录组方法揭示了PCOS分子基础的新见解，突出氧化应激反应的核心作用并识别GPX3作为连接代谢和生殖功能障碍的关键调控节点。这些发现为开发改进的诊断方法和针对这种复杂综合征基本分子机制的靶向治疗策略奠定了基础。