在肽囊中重组的膜蛋白的原位质谱分析

《RSC Chemical Biology》：Native mass spectrometry of membrane proteins reconstituted in peptidiscs

膜蛋白与脂质的结构解析对理解生物学功能至关重要，但传统方法因去脂和构象扰动而受限。本研究探索了peptidiscs（多肽盘）在原生质谱（native MS）中稳定膜蛋白的应用，以抗生素外排泵AceI和β- barrels组装机器（BAM）为对象。通过on-bead和on-column两种重构策略，发现on-column结合SEC纯化能有效减少杂质，提高光谱分辨率，尤其在BAM（约203 kDa五聚体）分析中表现突出。稀释至C8E4可降低释放能量（200 V HCD），同时保持复合体完整性。结果表明，peptidiscs可作为新型膜模拟环境，优化重构和释放条件可提升原生质谱对多亚基复合体的解析能力。

　　膜蛋白和脂质在细胞的各种生理过程中扮演着至关重要的角色，从细胞间信号传递到控制物质、能量和信息的跨膜运输。它们不仅是细胞膜结构的重要组成部分，还在细胞功能调控中发挥关键作用。然而，传统的结构生物学技术在研究膜蛋白时面临诸多挑战，主要原因是膜蛋白具有两亲性特性，其疏水区域在水性环境中极易发生聚集或结构破坏。因此，研究膜蛋白及其复合物的结构特性，需要一种能够在接近天然环境条件下保持其构象稳定性的方法。

为了克服这一难题，科学家们开发了多种膜模拟物（membrane mimetics），这些模拟物能够替代传统去垢剂，为膜蛋白提供一个更接近细胞膜的环境。其中，peptidiscs作为一种新型的膜模拟物，因其结构稳定性和对膜蛋白的保护能力，逐渐受到关注。peptidiscs由小的双螺旋肽组成，能够围绕膜蛋白的疏水核心，形成类似脂双层的结构，从而防止蛋白在水性环境中的聚集和结构变化。这种方法不仅能够维持膜蛋白的天然构象，还为后续的结构分析提供了便利。

本研究旨在探讨peptidiscs在天然质谱（native mass spectrometry, MS）分析中的应用潜力，特别是针对膜蛋白及其复合物。我们选择了两种具有代表性的膜蛋白：一种是抗生素抗性外排泵AceI，另一种是β-桶状组装机器（BAM complex）。这两种蛋白在细胞膜中发挥着不同的功能，AceI主要参与抗生素的外排过程，而BAM complex则是外膜蛋白生物合成的关键机器。通过使用“on-column”和“on-bead”两种不同的peptidisc组装方法，我们对这两种蛋白进行了重构，并利用天然质谱技术评估了其结构完整性与稳定性。

研究发现，AceI-Bril蛋白在peptidiscs中的重构效果较为理想。通过亲和层析纯化后，该蛋白能够保持其单体状态，并在天然质谱中显示出清晰的信号，表明其在peptidiscs环境中具有良好的结构稳定性。相比之下，BAM complex的重构则更为复杂，因为其为多亚基复合物，结构更加紧密，且容易与脂质或其他分子发生相互作用。在“on-bead”方法中，BAM complex的天然质谱结果显示了高度异质的信号，表明其在peptidiscs中可能与多种脂质和肽结合，导致信号重叠和难以解析。而通过“on-column”方法，BAM complex的天然质谱信号则更加清晰，表明该方法在重构复杂膜蛋白复合物时更具优势。

进一步的研究表明，peptidiscs在天然质谱分析中能够有效维持膜蛋白的天然构象，避免因去垢剂的使用而导致的结构破坏。然而，对于较大的膜蛋白复合物，如BAM complex，需要更精细的重构策略，例如在重构过程中加入少量去垢剂，以帮助蛋白从peptidiscs中释放出来，同时减少对天然结构的干扰。这种策略在天然质谱分析中表现出了良好的效果，能够提高信号分辨率，并减少亚复合物的形成。

此外，研究还发现，将peptidiscs样品稀释到含有低浓度去垢剂的缓冲液中，可以显著改善蛋白从peptidiscs中的释放效率和信号分辨率。这可能是因为去垢剂部分解除了peptidiscs对蛋白的束缚，使得蛋白能够在保持其天然构象的前提下更容易被释放。这一发现为未来利用peptidiscs进行天然质谱分析提供了新的思路，即在适当条件下结合去垢剂和peptidiscs的优势，以实现更高效的蛋白释放和结构解析。

本研究的结果表明，peptidiscs在天然质谱分析中具有广泛的应用前景。通过优化重构策略，可以有效减少样品的异质性，提高信号的清晰度和解析能力。这不仅有助于深入理解膜蛋白的功能和相互作用，也为开发针对膜蛋白靶标的药物提供了重要的结构信息。与传统的去垢剂环境相比，peptidiscs能够更好地模拟天然膜环境，保留蛋白与脂质或其他分子的相互作用，从而为膜蛋白的结构和功能研究提供了新的工具。

在实际应用中，peptidiscs的使用需要考虑多个因素，包括蛋白的大小、结构复杂性以及重构方法的选择。对于较小的膜蛋白，如AceI-Bril，使用“on-bead”方法即可获得良好的重构效果。而对于较大的膜蛋白复合物，如BAM complex，则需要采用“on-column”方法，并结合适当的去垢剂辅助，以确保蛋白的稳定性和天然状态的保持。此外，通过调整质谱分析的参数，如碰撞能量和离子捕获条件，也可以进一步优化信号的分辨率和解析能力。

总体而言，peptidiscs作为一种新型的膜模拟物，在天然质谱分析中展现出巨大的潜力。它们能够为膜蛋白提供一个接近天然的环境，同时保持其结构稳定性和功能活性。这一技术的优化和应用，不仅有助于揭示膜蛋白的结构和功能，还可能推动相关领域的研究进展，例如药物开发和细胞生物学机制的探索。未来，随着对peptidiscs重构策略的进一步优化，其在天然质谱分析中的应用将更加广泛和高效。