DEFB4拷贝数变异对单核细胞基因表达的影响：mRNA与蛋白水平的差异调控研究

《BMC Research Notes》：Influence of DEFB4 copy number variants on gene expression in monocytes

本研究针对DEFB4基因拷贝数变异(CNV)如何影响单核细胞中基因表达这一关键问题，通过ddPCR精准测定CN、qPCR检测mRNA表达和ELISA检测β-防御素2蛋白水平，发现DEFB4 CNV仅影响LPS刺激后的mRNA表达水平(rs=0.25, P<0.05)，而与基础及刺激后的蛋白表达无显著相关，揭示了CNV在转录与翻译水平存在差异调控的重要现象。

　　

在我们身体的免疫防御前线，有一支精锐部队——β-防御素家族，它们是由染色体8p23.1区域DEFB基因簇编码的阳离子抗菌肽。这个基因区域特别"活跃"，在不同人群中的拷贝数可以从2到12个不等，这种拷贝数变异(CNV)被认为与银屑病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、克罗恩病等多种疾病风险相关。然而，一个关键科学问题始终悬而未决：DEFB4基因的拷贝数变异究竟如何影响其在免疫细胞中的实际功能表达？

以往的研究如同"盲人摸象"，有的发现DEFB4 CNV与mRNA水平相关但缺乏蛋白水平验证，有的报道了蛋白水平的相关性却缺少mRNA数据。更令人担忧的是，许多研究采用的实时定量PCR(qPCR)方法在CNV测定上可能存在偏差。单核细胞作为先天免疫的重要参与者，虽然已知表达β-防御ensin 2，但DEFB4 CNV对其基因表达的全面影响仍是一片空白。

为了解开这个谜团，张向红等研究人员在《BMC Research Notes》上发表了一项精心设计的研究。他们首先在862名健康献血者中筛查DEFB4拷贝数，然后召回66名代表不同拷贝数的志愿者进行深入分析。研究人员采用微滴式数字PCR(ddPCR)这一精准技术重新测定拷贝数，同时通过qPCR检测mRNA表达，ELISA检测蛋白水平，系统分析了DEFB4 CNV对单核细胞基因表达的影响。

关键技术方法包括：从862名健康献血者中建立样本队列，通过旁系同源比率试验(PRT)初筛和ddPCR精确定量DEFB4拷贝数；利用免疫磁珠分选技术从外周血获得高纯度单核细胞；采用LPS刺激模拟炎症状态，通过qPCR结合预扩增技术检测低丰度DEFB4 mRNA，通过ELISA检测细胞内β-防御素2蛋白水平。

Determination of DEFB4 CN by PRT and ddPCR

研究团队首先通过PRT对862名志愿者进行DEFB4拷贝数筛查，然后使用更精确的ddPCR对66名召回志愿者的拷贝数进行重新测定。结果显示，两种方法在87%样本中结果一致，但PRT在13%样本中低估了1个拷贝。最终纳入分析的样本包括拷贝数2-9的个体，为后续表达分析奠定了可靠基础。

Association of DEFB4 CN with mRNA level

研究发现，在未刺激状态下单核细胞中检测不到DEFB4 mRNA，但经LPS刺激后可诱导表达。拷贝数与mRNA表达水平之间存在显著但较弱的相关性(Spearman检验，P<0.05，rs=0.25)。

Association of DEFB4 CN with protein level

有趣的是，虽然DEFB4拷贝数与血浆中β-防御素2水平显著相关(Spearman检验，P<0.05，rs=0.25)

，但在单核细胞中却表现出不同的模式。新鲜分离的单核细胞中即可检测到β-防御素2蛋白，但其基础水平与拷贝数无显著相关。

LPS刺激48小时后，细胞内β-防御素2水平显著升高(100.10±33.17 ng/ml vs. 33.68±10.40 ng/ml，配对t检验，P<0.0001)

，但仍与拷贝数无显著相关。

更重要的是，mRNA水平与蛋白水平之间也无显著相关性。

研究结论表明，DEFB4拷贝数变异对单核细胞基因表达的影响存在转录与翻译水平的"脱节"现象。这种差异可能源于单核细胞中β-防御素2独特的生物学功能——作为细胞内杀菌剂作用于吞噬后的病原体，而非分泌到细胞外。这种功能定位可能触发了特定的调控机制，使蛋白表达维持在适当水平，不受基因拷贝数的简单线性控制。此外，转录后调控机制如mRNA稳定性、非编码RNA介导的降解以及翻译效率等都可能参与这一复杂调控网络。

该研究的重要意义在于首次在原发性细胞中同时分析了DEFB4 CNV对mRNA和蛋白水平的全面影响，揭示了基因拷贝数与实际功能表达之间的复杂关系。研究结果提醒我们，在评估CNV的疾病风险机制时，需要超越简单的"基因剂量效应"思维，考虑细胞类型特异性、转录后调控以及蛋白质功能定位等多层次因素。这些发现为理解DEFB4相关疾病的发病机制提供了新视角，也为未来针对β-防御素通路的治疗策略开发提供了重要参考。