引导RNA热变性对Cas9核糖核蛋白负载的脂质纳米颗粒制剂质量的影响

《RSC Pharmaceutics》：The effect of guide RNA thermal denaturation on the quality of Cas9 ribonucleoprotein-loaded lipid nanoparticle formulations

基因编辑治疗中，sgRNA热变性处理显著优化了RNP-LNP复合物的均一性、电荷密度及递送效率，并通过冷冻电镜和分子量分析验证了其结构稳定性，最终在新生小鼠中实现高效基因敲除。

　　基因编辑技术在治疗遗传疾病方面展现出了巨大的潜力，而CRISPR/Cas9系统因其高效的基因靶向能力和简便的操作流程，成为当前研究的重点。该系统通过将Cas9蛋白与单链引导RNA（sgRNA）结合，形成RNA-蛋白复合物（即RNP），从而实现对特定DNA序列的精确编辑。然而，在将这些RNP用于体内治疗时，如何高效且特异性地将其递送至目标细胞和组织，依然是一个重要的技术挑战。为了克服这一障碍，研究人员探索了多种递送系统，其中脂质纳米颗粒（LNPs）因其非病毒特性而成为一种有吸引力的载体。LNPs不仅可以将核酸和蛋白包裹起来，还能帮助其穿过细胞膜，为基因编辑疗法提供了新的可能性。

近年来，随着技术的发展，RNP的体内递送已取得了一定的进展。然而，目前对于RNP结构及其对递送效果的影响研究仍然有限。本研究聚焦于sgRNA的结构异质性对其负载到LNPs中的复合物结构、物理特性和基因敲除效率的影响。sgRNA在合成过程中可能形成复杂的二级和三级结构，这些结构会影响其与Cas9蛋白的结合效率以及最终的基因编辑效果。为了更好地理解这些结构变化如何影响RNP的性能，研究者通过热变性处理来消除sgRNA的结构异质性，并分析了其对RNP-loaded LNPs的性能影响。

研究发现，未经热变性的sgRNA通常会形成多聚体结构，这可能导致RNP的不均匀性和较低的基因编辑效率。相比之下，经过热变性的sgRNA能够形成较为均一的单体结构，从而提高了RNP的封装效率和体内活性。这一现象在多个实验中得到了验证，包括通过原位凝胶电泳（native-PAGE）和圆二色光谱（CD）分析sgRNA的结构变化。热变性处理后，sgRNA的分子量分布变得更加集中，同时其电荷密度也有所增加，这表明热变性能够改善RNP的均一性，并提高其与LNPs的结合能力。

此外，研究还发现，热变性处理后的RNP-loaded LNPs在体内表现出更强的基因敲除效果。例如，在小鼠模型中，经过热变性的RNP-loaded LNPs能够更有效地靶向肝脏细胞，并显著降低血清中的转甲状腺素蛋白（TTR）水平。这表明，热变性不仅有助于提高RNP的封装效率，还可能通过改变其结构特性，增强其在体内的稳定性和靶向性。特别是，这些RNP-loaded LNPs表现出良好的冻融稳定性，这使得它们在临床应用中更具可行性，尤其是在需要长期储存的场景下。

在实际应用中，基因编辑疗法的开发和推广仍面临诸多挑战。一方面，基因编辑技术需要高度精确的靶向能力和可控的递送效率；另一方面，如何确保RNP在体内的安全性和有效性也是关键问题。例如，虽然LNPs作为非病毒载体在递送过程中具有一定的优势，但其对细胞的靶向性、在血液中的稳定性以及对不同组织的渗透能力，都需要进一步优化。此外，由于基因编辑疗法通常需要较高的剂量和特定的给药方式，如何在不增加副作用的前提下提高治疗效果，是当前研究的重点方向之一。

为了应对这些挑战，研究人员不仅关注sgRNA的结构优化，还致力于改进LNPs的配方和制备工艺。例如，通过调整脂质成分的比例，可以提高LNPs的封装效率和稳定性；而通过引入化学修饰，可以增强sgRNA的活性并减少其形成多聚体的可能性。同时，研究还发现，RNP的结构异质性可能会影响其在体内的行为，如细胞摄取、靶向性和基因编辑效率。因此，为了提高基因编辑疗法的整体效果，必须对sgRNA的结构和RNP的组装过程进行深入研究，并找到最优的递送方案。

值得一提的是，尽管基因编辑疗法在成人患者中已有一定的临床应用，但在儿童群体中的研究和应用仍然相对较少。这主要是由于儿童的生理特点和基因表达模式与成人存在差异，因此需要专门设计适用于儿童的递送系统和治疗方案。然而，近年来随着个性化医疗和精准治疗的发展，基因编辑疗法在儿童中的应用前景正在逐步显现。例如，一些针对罕见遗传病的基因疗法已经获得了批准，并在临床试验中表现出良好的安全性和有效性。这些成功案例为未来在儿童群体中推广基因编辑疗法提供了重要的参考。

在本研究中，研究人员通过实验验证了热变性处理对RNP-loaded LNPs性能的积极影响。他们发现，热变性能够显著改善RNP的结构均一性，并提高其在体内的基因敲除效果。同时，热变性处理后的RNP-loaded LNPs表现出更强的冻融稳定性，这为长期储存和运输提供了便利。这些发现不仅有助于优化基因编辑疗法的递送系统，还为未来的临床应用奠定了基础。特别是，该研究在小鼠模型中成功验证了RNP-loaded LNPs在新生儿中的有效性，为未来在人类婴儿中的应用提供了重要的数据支持。

总体而言，基因编辑技术的进步为遗传疾病的治疗带来了新的希望。然而，要实现其在临床中的广泛应用，仍需解决多个关键问题。其中包括如何提高RNP的封装效率和体内稳定性，如何优化sgRNA的结构以提高其与Cas9的结合能力，以及如何确保治疗的安全性和有效性。此外，还需要进一步探索不同基因编辑技术在不同人群中的适用性，特别是在儿童群体中的应用潜力。随着研究的深入和技术的不断进步，相信未来基因编辑疗法将在更多领域得到应用，并为患者带来更好的治疗效果。