综述：单细胞水平微生物种群与群落异质性分析

《mLife》：Profiling the heterogeneity of microbial populations and communities at the single-cell level

这篇综述系统梳理了单细胞技术（如scRNA-seq、FISH、Raman光谱）在微生物异质性研究中的最新进展，涵盖了单细胞基因组学、转录组学、空间测序和分子成像等核心方法。文章重点探讨了这些技术如何揭示微生物群落的表型/基因型异质性、空间结构及其在宿主-微生物互作（如肠道菌群）中的功能应用，同时指出了技术局限性与整合多组学（如MiP-seq）的未来方向。

　　

单细胞水平微生物异质性分析技术综述

微生物在生态系统中扮演着关键角色，但其群落并非均质体系，而是存在显著的基因型、表型和空间异质性。传统测序技术难以捕捉这种异质性，而单细胞技术的兴起为在单细胞分辨率下解析微生物群落的结构和功能提供了全新视角。

高通量测序技术

单细胞基因组学

单细胞基因组测序通过随机封装（如微滴乳液、荧光激活细胞分选FACS）或显微操作（如激光捕获显微切割LCM）分离单个细胞，并利用多重置换扩增（MDA）等技术进行全基因组扩增。该方法能够鉴定不可培养微生物、捕获水平基因转移（HGT）和噬菌体-宿主互作，但存在扩增偏倚和基因组覆盖不均等局限性。新方法如WGA-X通过使用热稳定性phi29 DNA聚合酶改善了高GC含量基因组的覆盖度。

单细胞转录组学

细菌单细胞RNA测序（scRNA-seq）面临细胞壁裂解效率低、mRNA丰度低（仅占RNA的1%-2%）、无poly(A)尾及rRNA干扰等挑战。MATQ-seq采用随机引物逆转录，可检测每个细胞约200个转录本；PETRI-seq和microSPLiT通过原位组合索引实现数万个细胞的高通量分析；RiboD-PETRI结合rRNA衍生cDNA去除策略，将mRNA检测率提升至92%。基于10× Genomics平台的ProBac-seq和BacDrop利用探针或微滴条形码技术，但前者依赖已知基因组设计探针，后者每个细胞捕获mRNA数不足100。smRandom-seq通过随机引物和CRISPR介导的rRNA去除，实现了物种普适性转录组分析。M3-seq则采用扩增后rRNA去除策略，支持多物种多条件并行检测。

空间测序

原位测序（ISS）和微滴条形码技术（如MaPS-seq）通过冷冻破碎样本和空间条形码捕获，实现了微生物群落的微米级空间共定位分析。INVADEseq和空间宿主-微生物组测序（SHM-seq）整合宿主转录组与微生物16S rRNA测序，揭示了肿瘤微环境等场景中宿主-微生物的空间互作。空间宏转录组（SmT）进一步通过多模态阵列同步分析宿主基因表达和微生物功能，在植物叶片中识别出微生物热点区域。

分子成像技术

光谱编码FISH

荧光原位杂交（FISH）通过靶向16S rRNA的寡核苷酸探针实现微生物可视化。组合标记与光谱识别FISH（CLASI-FISH）利用多种荧光素组合标记，可同时区分数十种微生物；高系统发育分辨率微生物图谱FISH（HiPR-FISH）通过10种荧光素的组合实现1023种菌株的识别。顺序错误鲁棒FISH（SEER-FISH）通过多轮杂交-成像循环，可绘制130个菌株的空间分布图谱。平行顺序FISH（par-seqFISH）和细菌多重错误鲁棒FISH（Bacterial-MERFISH）结合扩增显微镜技术，实现了单细胞分辨率下微生物分类与转录谱的同步分析，揭示了碳源转换等过程中基因表达的异质性。

代谢标记成像

基于d-氨基酸代谢探针的顺序标记（STAMP）可追踪细菌细胞壁合成动态，结合流式分选和测序，能够评估粪便微生物移植（FMT）后菌群的定植存活情况。通过生物正交点击化学标记多糖或胆固醇等代谢物，可可视化微生物在宿主组织中的分布及其与免疫细胞的互作。

单细胞拉曼光谱（SCRS）

拉曼光谱无需标记即可获取细胞的化学键“分子指纹”，通过拉曼组（Ramanome）分析可定量单细胞代谢活性（如氢气、碳源利用）。拉曼激活细胞分选（RACS）耦合测序（scRACS-Seq）或培养（scRACS-Culture）技术，实现了基于表型的基因型解析，如从胃活检样本中快速鉴定耐药菌株。

红外光谱与质谱

光学光热红外（O-PTIR）光谱可无标记检测单细胞代谢物（如聚羟基丁酸酯PHB），揭示生物膜发育中的表型异质性。质谱（MS）结合微流控技术实现了微生物单细胞代谢物分析，但面临检测灵敏度与通量的挑战。

活体成像

生物发光成像、近红外（NIR）荧光标记和光声成像（PAI）等技术支持实时监测微生物在肠道等体内的定植、代谢和空间动态，为研究微生物-宿主互作提供了动态视角。

技术挑战与整合方向

当前单细胞技术仍存在细胞裂解效率低、扩增偏倚、rRNA干扰、探针多重性有限等挑战。未来趋势在于整合多组学技术（如空间多组学MiP-seq），结合代谢标记、FISH和拉曼光谱，在单细胞水平关联表型与基因型，从而揭示复杂微生物群落中关键功能菌株的生态作用。计算方法的开发也将助力多维度数据整合，推动微生物异质性研究在健康、疾病和环境领域的应用。