综述：外泌体促进肺癌前转移灶形成

本综述系统阐述了肺癌源性外泌体（LCDEs）在肺癌前转移灶（PMN）形成中的核心作用。文章创新性地建立了首个基于功能（免疫抑制、血管生成、基质重塑）的LCDEs分类体系，深入探讨了其分子机制（如PD-L1、miR-21a等关键分子），并评估了其作为生物标志物和药物载体的临床转化潜力，为开发肺癌转移防治新策略提供了重要见解。

　　

引言

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其预后不良的主要驱动因素是远处转移。在此过程中，前转移灶（Pre-metastatic Niche, PMN）的形成是一个关键早期事件。肿瘤细胞通过释放包括外泌体在内的多种因子，重塑远处器官的微环境，为循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells, CTCs）的定植和生长创造有利条件。外泌体携带蛋白质、RNA和脂质等多种分子货物，在PMN形成中扮演着 pivotal 角色。它们通过促进免疫逃逸、血管生成和细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）重塑，调节免疫细胞、内皮细胞和成纤维细胞等多种微环境组分，从而增强癌细胞的转移潜能。

肺癌外泌体的背景

外泌体是细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）的一种亚型，直径约30-150纳米，具有磷脂双分子层结构，这使其在运输过程中能保持完整性，确保其内容物的生物活性。外泌体通过内吞作用形成多泡体（Multivesicular Bodies, MVBs），随后MVB与细胞膜融合将其释放到细胞外。在肺癌中，肿瘤相关细胞通过分泌外泌体与周围微环境及远处器官进行通信。

LCDEs表现出独特的分子特征，如膜蛋白（Alix, TSG101）、小GTP酶（Rab家族蛋白）、四跨膜蛋白（CD9, CD63, CD81）、肿瘤相关抗原（如CA125, CEA）和糖蛋白（如LRG1）。外泌体的来源具有显著的异质性，主要来源于肿瘤细胞、免疫细胞、癌症相关成纤维细胞（Cancer-Associated Fibroblasts, CAFs）等。这种异质性在肺癌不同亚型和转移过程中扮演着不同角色。例如，肺鳞状细胞瘤来源的外泌体整合素a3β1可与脑组织结合，显著增强肿瘤细胞的脑转移能力。

PMN是指循环肿瘤细胞到达转移部位之前，通过多种机制在靶器官中形成的利于CTCs定植和生长的特定微环境。LCDEs在PMN形成中发挥重要作用，其建立涉及免疫抑制、血管生成和基质重塑等多种细胞和分子过程。

外泌体促进PMN形成的机制

LCDEs调控的转移级联反应是一个动态的、多器官的病理进程。原发肿瘤细胞释放携带特定分子标记（如整合素、miRNA）的LCDEs，这些囊泡通过循环系统传播，利用表面分子（如ITGA3/ITGB1）实现向特定靶器官（如肝、脑、骨）的归巢。到达目的地后，LCDEs通过旁分泌机制重塑局部微环境，最终建立功能性的PMN。

外泌体导致PMN内的免疫抑制

免疫系统是抵御肿瘤转移的关键防线。正常情况下，CD8⁺ T细胞、单核细胞和自然杀伤（Natural Killer, NK）细胞等能产生抗肿瘤效应。然而，肺癌相关细胞产生的外泌体通过多种机制促进正常免疫细胞转化为支持肿瘤生长的状态。

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  髓源性抑制细胞（MDSCs）的募集与扩增：LCDEs通过招募MDSCs来调节免疫反应。例如，外泌体富含的miR-21a通过下调程序性死亡蛋白4（Programmed Cell Death 4, PDCD4）的表达诱导MDSCs的扩增。聚集的MDSCs进一步通过分泌S100A8/A9蛋白增强免疫抑制微环境。
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  T细胞功能抑制：LCDEs通过上调程序性死亡配体1（Programmed Death-Ligand 1, PD-L1）来逃避免疫监视。例如，非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC）组织中高表达的circ-CPA4通过抑制miRNA-let-7上调外泌体中的PD-L1，从而抑制微环境中T细胞的功能。PD-L1通过与T细胞表面的PD-1结合，招募SHP-2，抑制PI3K/AKT和MAPK信号通路的磷酸化，进而抑制T细胞的增殖、活化和存活。
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  NK细胞功能抑制：LCDEs影响NK细胞的抗肿瘤功能。例如，外泌体表面高表达的HLA-E和HLA-G作为NK细胞抑制性受体CD94/NKG2A和免疫球蛋白样转录物2（Immunoglobulin-like Transcript 2, ILT2）的配体，抑制NK细胞活化。
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  巨噬细胞极化：LCDEs介导的巨噬细胞极化是PMN形成的关键步骤。外泌体中的长链非编码RNA（Long Non-coding RNA, lncRNA）（如lncRNA-HOXC-AS2、lncRNA-00313）和环状RNA（Circular RNA, circRNA）（如circ-PLEKHM1、circ-PVT1）以及 miRNA（如miR-1290、miR-21）通过调节STAT1、STAT6、JAK/STAT3等信号通路，诱导巨噬细胞向M2表型极化。M2型巨噬细胞分泌IL-10、TGF-β等免疫抑制因子，强化免疫抑制微环境。LCDEs还可通过结合巨噬细胞表面的Toll样受体2（Toll-like Receptor 2, TLR2）激活NF-κB信号通路，增强巨噬细胞糖酵解，增加乳酸产生，进而通过NF-κB通路促进巨噬细胞表面PD-L1的表达，抑制T细胞活性。

外泌体促进PMN中的血管生成

血管生成在肿瘤发展和转移中起关键作用，为肿瘤细胞提供氧气和营养，清除代谢废物，并为其进入循环系统提供途径。LCDEs通过携带多种生物活性分子（如miRNA、lncRNA、蛋白质）调节血管生成相关信号通路，刺激内皮细胞增殖和迁移。

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  miRNA的作用：例如，miR-130a-3p通过上调RAC1和NRP2激活PI3K/Akt信号级联促进血管生成；miR-23a通过抑制紧密连接蛋白ZO-1增强血管通透性；miR-210通过激活成纤维细胞中的JAK2/STAT3信号通路，增加MMP9、FGF2和VEGF等促血管生成因子的表达。
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  lncRNA的作用：例如，lncRNA-MFI2-AS1作为miR-107的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA, ceRNA），抵消其对NFAT5的抑制，从而激活PI3K/AKT信号级联；lncRNA-GAS5竞争性结合miR-29-3p，增加PTEN表达，进而增强PI3K/AKT信号通路。
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  蛋白质的作用：例如，m6A甲基化阅读器蛋白IGF2BP2通过m6A修饰增强FLT4 mRNA的稳定性，激活PI3K/Akt信号级联；LRG1通过TGF-β信号通路增强内皮细胞增殖和血管生成；SYT7将含有CEP55的分子转移至人脐静脉内皮细胞（HUVECs），激活mTOR信号通路促进血管生成。

此外，LCDEs还通过下调血管生成抑制因子（如HIPK2、TIMP2、KLF2）来促进血管生成。

外泌体促进PMN的基质重塑

在肿瘤转移过程中，细胞外基质（ECM）的重塑是支持肿瘤细胞扩张、侵袭和扩散的关键过程。LCDEs通过重编程PMN内的基质细胞（如CAFs）来介导这一过程。

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  成纤维细胞转化为CAFs：肺癌细胞分泌外泌体将静止的成纤维细胞转化为CAFs。例如，LCDEs中的ITGB6通过激活KLF10正反馈环和增强TGF-β信号诱导正常基质成纤维细胞转化为CAFs。CAFs在肿瘤微环境中分泌TGF-β、基质衍生因子-1α（SDF-1α）、S100A4、纤连蛋白和基质金属蛋白酶（MMPs）等多种促肿瘤因子，在基质重塑和肿瘤细胞迁移中发挥重要作用。
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  基质金属蛋白酶（MMPs）的激活：LCDEs通过调节肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）向M2表型极化，促进MMPs的分泌。M2巨噬细胞分泌的MMP-2和MMP-9是降解ECM的主要酶类，为肿瘤细胞侵袭提供空间。例如，外泌体miR-106b通过靶向PTEN，增加MMP-2和MMP-9的表达。

外泌体在肺癌中的生物标志物和治疗应用

作为生物标志物

LCDEs携带的货物（包括miRNA和蛋白质）被认为是一种有前景的非侵入性工具，可用于肺癌的早期诊断、预后判断和治疗反应监测。例如，血清外泌体中的CKAP4、GCC2、PD-L1等蛋白在肺癌患者中高表达，具有诊断潜力。外泌体PD-L1水平与淋巴结转移呈显著相关，其定量检测可能有助于预测患者对抗PD-1免疫疗法的反应。RNA生物标志物如LncRNA-RP5-977B1也显示出较高的诊断潜力（AUC值0.8899）。外泌体检测技术包括电化学生物传感器、表面增强拉曼光谱（SERS）、ELISA、Western Blot、表面等离子体共振（SPR）和PCR等，但其临床转化仍面临挑战。

在治疗中的应用

由于外泌体具有天然的归巢效应和优异的生物分子携带能力，它们已成为有前景的药物递送载体。通过电穿孔等技术可将化疗药物或RNA分子加载到外泌体中，并通过修饰增强其靶向递送准确性。例如，源自嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）的工程化外泌体已被用作药物递送载体，在肺癌小鼠模型中能减小肿瘤体积并延长生存期。外泌体也可携带特定的RNA分子（如siRNA和miRNA）以靶向并沉默癌细胞中的关键基因。

局限性与挑战

LCDEs的临床应用仍面临诸多挑战：

1. 1.
   异质性：外泌体来源多样，其组成和功能可变性高，导致不同患者和肿瘤类型间的特异性和敏感性存在差异。
2. 2.
   分离与纯化技术：超速离心、免疫亲和、尺寸排阻色谱等方法在临床应用中存在效率低、成本高、操作复杂等问题。
3. 3.
   载药效率与靶向性：外泌体载药效率相对较低，其靶向递送能力受其膜表面标记物和肿瘤微环境影响。
4. 4.
   治疗耐药性：肿瘤细胞通过外泌体传递耐药信息，增强对化疗的耐药性。例如，circVMP1通过靶向miR-524-5p-METTL3/SOX2轴促进NSCLC的顺铂耐药。

临床应用现状

目前，SOB100是唯一进入临床I期的基于外泌体的肺癌治疗项目，这是一种在其表面表达HLA-G纳米抗体的基因工程外泌体，旨在将药物靶向递送至肿瘤微环境。其他研究，如哥伦比亚大学开发的吸入式IL-12 mRNA外泌体、哈尔滨医科大学开发的TMTP1肽修饰的外泌体递送系统等仍处于临床前阶段。

结论与展望

LCDEs通过其多样的分子货物，在PMN形成中起着至关重要的作用，促进了肺癌的转移扩散。尽管外泌体在诊断和治疗方面展现出巨大潜力，但其异质性、分离技术限制、载药效率以及介导治疗耐药等问题仍是临床应用的障碍。未来研究应侧重于克服这些障碍，包括推进外泌体的分子表征、开发标准化的分离和载药方法、研究其在治疗耐药中的作用，以及探索外泌体靶向治疗与现有治疗策略（如免疫疗法和抗血管生成治疗）的联合应用。随着外泌体研究的深入和技术进步，其有望在肺癌的精准治疗中发挥关键作用。