通过联合补充嗜酸乳杆菌（Pediococcus acidilactici）和接种流感疫苗，提高肉鸡的免疫调节能力、生长性能和肠道健康

《Veterinary Medicine and Science》：Enhancing Immune Modulation, Growth Performance and Gut Health in Broiler Chickens Through Combined Pediococcus acidilactici Supplementation and Influenza Vaccination

益生菌Pediococcus acidilactici与流感疫苗联用显著提升肉鸡免疫应答、生长性能及肠道健康，通过增强细胞因子平衡（IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-10）和改善肠道形态（Villus height/Crypt depth），同时优化饲料转化率。

　　在现代养殖业中，家禽健康与生产性能是保障食品安全和满足全球日益增长的优质动物蛋白需求的关键因素。然而，集约化养殖环境也带来了诸多挑战，包括感染性疾病、氧化应激以及与食源性病原体相关的经济损失。这些问题促使人们寻求可持续、创新的解决方案，以提升家禽的健康状况和生产效率，同时减少对传统抗生素的依赖，因为抗生素的广泛使用可能导致耐药性产生和食品链中残留物的积累。近年来，益生菌，尤其是乳酸菌（LAB）在支持家禽健康方面的作用得到了越来越多的关注。这类益生菌不仅能够改善免疫功能，还能增强肠道健康和促进营养吸收。研究显示，Pediococcus acidilactici（PediGuard）的补充能够改善肠道微生物群平衡，刺激有益代谢物如乳酸和细菌素的产生，并增强对肠道和呼吸道病原体的抵抗力。

Pediococcus acidilactici 特别是菌株 CNCM I-4622，已被证明在改善家禽营养吸收、钙储存和骨骼矿化方面具有潜力。该菌株通过提升产蛋性能、营养吸收和蛋品质，为支持动物健康提供了非抗生素的替代方案，且不会对食品链造成不良影响。此外，CNCM I-4622 对肠道-骨骼轴（即肠道健康与骨骼强度之间的关系）的影响表明，其可能在促进肠道和骨骼健康方面具有双重作用，尤其是在营养吸收受挑战的环境下。

考虑到当前禽流感疫苗接种方案在保护范围上的局限性，例如对多种病毒株的保护不完全，益生菌作为天然免疫调节剂的潜力尤为显著。益生菌，包括 Pediococcus acidilactici，已被证实具有抗病毒特性，可能支持疫苗接种后的免疫反应，从而增强对禽流感等感染的保护能力。这种辅助效应可能提高免疫应激反应能力，降低病毒载量，并增强细胞因子调节，从而为家禽提供更广泛和持久的防御机制。

本研究首次系统评估了 PediGuard 益生菌与 H9N2 禽流感疫苗的协同作用，采用整合方法研究了家禽的生长性能、肠道形态、免疫细胞因子谱以及益生菌衍生肽与宿主模式识别受体（PRRs）的分子对接。与以往仅关注疫苗前益生菌活性或未观察分子机制的研究不同，本研究首次结合了体内生理和组织学事件与计算机模拟的受体-配体相互作用分析，揭示了益生菌与疫苗联合使用如何增强宿主免疫。这种整合方法为家禽生产中的免疫营养建立了新的范式，并填补了当前关于宿主-微生物-疫苗相互作用知识的空白。

在研究设计方面，本实验采用完全随机块试验方法，从2019年9月1日持续到2020年6月1日，在伊朗乌尔米亚大学动物科学系进行。伦理审查委员会已批准该研究，并确认其符合动物实验伦理规范。实验中，300只罗斯308公雏鸡在第一天被称重，并按体重匹配在±5%的整体平均值内分配到四个处理组，以减少基线异质性。这些处理组包括对照组（仅基础饲料）、益生菌组（基础饲料加 Pediococcus acidilactici，浓度为每克饲料1×10? CFU）、疫苗组（基础饲料加灭活 H9N2 禽流感疫苗）以及益生菌与疫苗联合组（基础饲料加 Pediococcus acidilactici 和疫苗）。为防止处理组之间交叉污染，实验采用高密度聚丙烯网分隔不同处理组。

在饲养管理方面，雏鸡被饲养在深床地板栏中，使用5-7厘米的窑干松木屑作为垫料，每周更换一次以减少微生物积聚。孵化温度从42°C开始，每周减少2°C-3°C，相对湿度维持在55%-65%。实验全程采用12小时光照：12小时黑暗的光周期和负压通风。饲料和水通过手动槽和乳头饮水器提供，确保自由获取。

在饲料配方方面，实验采用商业颗粒饲料，分为三个阶段：雏鸡阶段（第2-9天）、生长阶段（第10-22天）和育肥阶段（第23-35天）。饲料配方在代谢能（约12.6-13.0 MJ/kg）和粗蛋白水平（19%-23%）上保持一致，基于 Jazi 等人（2019）报告的营养矩阵。在实验开始前，通过近红外光谱法确认了饲料成分和近似值。

在实验处理方面，每组有三个重复栏，每个栏25只鸡，共计75只。对照组仅使用基础饲料，益生菌组在基础饲料中加入 Pediococcus acidilactici，浓度为每克饲料1×10? CFU，疫苗组在基础饲料中加入灭活 H9N2 禽流感疫苗，益生菌与疫苗联合组则同时加入两者。疫苗剂量和益生菌添加率是根据之前的实验结果进行优化的，旨在提高生长性能和免疫状态。为防止鸡群之间交叉污染，使用了高密度聚丙烯网分隔不同处理组。

在益生菌的制备、添加和活性方面，Pediococcus acidilactici 在厌氧条件下于 MRS 培养基中培养（37°C，24小时），离心（3000 × g，10分钟，4°C），用无菌0.85%生理盐水洗涤两次后，重新悬浮至每克10? CFU 的浓度。悬浮液通过旋转桨式混合器与冷却的颗粒饲料均匀混合90秒，以确保均匀分布。这种方法确保了干燥后的益生菌活性达到≥9.0 log10 CFU/g，与之前报道的高混合乳酸菌的 >90% 保留率一致。

在禽流感 H9N2 疫苗选择和接种方面，实验采用基于 A/Chicken/Iran/728/2012 株的油乳剂灭活 H9N2 疫苗，该株与流行菌株相似。疫苗组和益生菌与疫苗联合组的鸡在第3天接种0.5 mL，以配合母源抗体的下降，并利用证据表明匹配株疫苗可诱导更强的系统和黏膜免疫。这种设计旨在提高疫苗的保护效果。

在采样计划和实验室分析方面，实验在第14、21和35天从每组中随机选择五只鸡进行颈静脉采血，以检测血凝抑制滴度和细胞因子浓度（IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α）。使用商业 ELISA 试剂盒进行分析，确保结果的准确性。在每组中，每组随机选择两只鸡进行以下分析：十二指肠、空肠和回肠的消化物pH分布、空肠组织切片（3 cm 中段）的固定、石蜡包埋、苏木精-伊红染色及绒毛高度（VH）、隐窝深度（CD）和绒毛/隐窝比值的测定。此外，使用系列10倍稀释法对盲肠内容物进行平板培养，分别统计乳酸菌、双歧杆菌、肠杆菌和沙门氏菌的数量，以评估益生菌对肠道微生物群的影响。

在肠道健康和形态方面，实验在第35天对每组中的6只鸡进行肠道健康测试。使用校准的数字微电极探针测定盲肠、空肠和十二指肠消化物的pH水平，以评估区域酸度模式和发酵动力学。空肠组织活检样本（3 cm 中段）被取出，用生理盐水清洗后固定于10%中性缓冲福尔马林中48小时。随后进行脱水、石蜡包埋、切片（厚度为5 μm）和苏木精-伊红（H&E）染色，以测量绒毛高度、隐窝深度和绒毛/隐窝比值。所有测量均通过ImageJ在光学显微镜下完成，遵循Xu等人（2003）的标准操作流程。

在对接研究方面，实验通过分子对接模拟探索了益生菌衍生肽与免疫受体的潜在相互作用。从RCSB蛋白质数据库中获取了所选肽和受体（如TLR2、MHC-II）的三维结构，并在MOE 2019中进行结构准备，包括质子化状态分配、氢原子添加以及去除距离受体超过4.5 ?的水分子。对接遵循双级策略，首先使用MOE 2019进行初始对接，生成S-评分（亲和力估计）和E_refine值，以评估形状互补性和分子相互作用。随后使用ClusPro 2.0进行精修和聚类分析，通过平衡和静电评分模式识别稳定的结合构象，并按群体和能量评分对聚类进行排序。这些模拟提供了关于益生菌成分如何增强免疫原性或调节免疫信号通路的机制性见解。

在统计分析方面，实验数据以均值±SEM形式呈现，并使用SPSS v26进行单因素方差分析，随后进行Tukey的HSD事后检验。差异在p < 0.05时被认为是显著的。实验单位为栏，所有分析遵循随机完全区组设计（RCBD）假设，以考虑栏间变异和重复结构。

在计算机模拟和分子相互作用分析方面，为了阐明Pediococcus acidilactici衍生的pediocin PA-1在体内的免疫调节机制，实验进行了整合的计算机模拟流程，包括结构筛选、刚体对接、能量过滤和初步的动态稳定性评估。配体受体对为pediocin PA-1（PDB ID 7VLY）和鸡TLR4的胞外亮氨酸丰富重复域（LRR）。两个结构在pH 7.4下进行质子化，并在MOE 2019中进行能量最小化，以去除立体障碍。

对接过程采用了双引擎策略，首先使用MOE 2019进行初始对接，生成S-评分（亲和力估计）和E_refine值，以评估形状互补性和分子相互作用。随后使用ClusPro 2.0进行精修和聚类分析，通过平衡和静电评分模式识别稳定的结合构象，并按群体和能量评分对聚类进行排序。这些模拟提供了关于益生菌成分如何增强免疫原性或调节免疫信号通路的机制性见解。

在对接研究的局限性和未来方向方面，当前的对接仅限于刚性受体，因此可能未能充分代表侧链的可塑性和长程静电相互作用。此外，仅模拟了TLR4的胞外域，而完整的蛋白包括TIR域的模拟可能揭示配体依赖的变构效应。计划通过100纳秒的原子水平分子动力学模拟，使用TIP3P水和CHARMM36m参数进行前处理，随后进行MM-PBSA自由能分析。此外，进行转录水平验证（RT-qPCR分析TLR4-MyD88通路基因），以交叉验证计算机模拟结果。

在体外血单核细胞存活率的评估方面，研究了Pediococcus acidilactici及其衍生物对血单核细胞（PBMCs）存活率的影响。实验包括完整的益生菌细胞、各种细胞质提取物（Cyto 10、Cyto 20、Cyto 30、Cyto 40）以及细胞壁组分（CW 50、CW 100、CW 200、CW 400）。实验在四个时间点（24、48、72和96小时）进行，细胞存活率通过标准协议评估。所有处理组的PBMC存活率均保持在99.7%以上，与对照组相比无显著降低（p > 0.05）。单因素方差分析和Tukey事后检验显示，所有处理组均未显示出细胞毒性效应，表明这些益生菌成分在实验条件下对PBMC无害。效应量（部分η2 < 0.01）确认了对细胞存活率的最小影响，表明这些化合物与PBMC的兼容性良好。

在细胞因子的产生方面，Pediococcus acidilactici及其衍生物对关键细胞因子IL-1、IL-6、IL-10和TNF-α的影响被评估。结果显示，细胞质提取物，特别是Cyto 20和Cyto 40，显著增加了IL-1和IL-6的水平，与对照组相比（p < 0.05），表明其具有显著的促炎激活能力。这些提取物似乎作为先天免疫通路的强效刺激物，增强炎症信号并可能为免疫系统准备防御机制。然而，缺乏对时间动态数据的分析限制了我们对这些反应持续时间的理解，这对临床应用至关重要。值得注意的是，Cyto 40处理组中IL-1水平的较大误差范围表明存在一定的变异性，未来的研究可以通过增加重复次数来确认这些初步发现。

在细胞因子的产生中，除了促炎标志物，Cyto 40还显著提高了IL-10的水平（p < 0.05），这是一种在免疫调节中起核心作用的细胞因子。这种双重效应表明Cyto 40可能通过调节激活和抑制通路，促进平衡的免疫反应，这在治疗应用中可能是有益的。IL-10的产生在完整的益生菌细胞和CW 100中也有所增加，但程度较低，表明这些处理可能支持适度的免疫反应，适合长期健康维护。

在抗体反应增强方面，研究了PediGuard与禽流感疫苗联合使用对抗体滴度的影响。结果显示，与仅接种疫苗的组相比，联合组在第7、14和21天的抗体滴度显著提高（p < 0.05）。最高滴度出现在同时接受益生菌和疫苗的组，表明这种联合使用可能显著增强适应性免疫反应。这可能是由于增强了抗原呈递和T细胞激活，如在类似乳酸菌菌株的研究中所报告的。这些发现突显了益生菌作为家禽疫苗接种计划的重要补充工具的潜力。

在生长性能和饲料效率方面，研究发现PediGuard的补充显著改善了家禽的生长指标，包括体重增长、特定生长率和饲料转化率（FCR）。这些结果表明，益生菌对肠道健康和营养吸收的有益作用促进了整体生长性能的提升。研究结果与Bajagai等人（2016）的研究一致，他们指出Pediococcus acidilactici显著提高了肠道绒毛长度和隐窝深度，从而增强营养吸收能力。

在肠道pH和微生物群落的分析方面，PediGuard对肠道环境的影响进一步通过测量肠道内容物的pH值和分析微生物群落进行评估。结果显示，接受PediGuard补充的组肠道pH值略有下降，但无显著差异。这种下降表明PediGuard可能通过乳酸等有机酸的产生，降低肠道pH值，从而抑制病原菌的生长，同时提高矿物溶解度和刷状缘酶活性。酸性的肠道环境还可能促进短链脂肪酸（SCFAs）的产生，尤其是丁酸，其为肠上皮细胞的增殖和紧密连接提供能量，从而维持肠道屏障的完整性。

在肠道形态的组织学改善方面，实验通过肠道组织切片分析进一步证实了PediGuard对肠道健康的益处。结果显示，PediGuard显著增加了绒毛长度和隐窝深度，表明吸收表面积的扩展。益生菌通过抑制有害微生物的生长，使更多营养物质可供宿主利用。此外，它们还影响肠道组织，通过增加绒毛长度、减少上皮厚度和降低肠道上皮细胞的更新率，促进肠道健康。

在肠道形态改善的机制方面，Pediococcus acidilactici通过重塑肠道微生物群，最终改善肠道吸收面积。首先，其乳酸介导的酸化降低了肠道内容物的pH值，从而抑制病原菌的生长，并提高矿物溶解度和刷状缘酶活性。酸性的肠道环境还可能促进SCFAs的产生，如丁酸，其为肠上皮细胞的增殖和紧密连接提供能量，从而维持肠道屏障的完整性。同时，益生菌刺激胃和胰腺酶的释放，并增强黏液分泌，加速大分子的水解和食糜的通过。最终的营养微环境与对病原菌的竞争抑制相结合，减少了炎症成本，并将代谢能量重新分配给生长。

在肠道形态改善的机制方面，这些生化变化可能激活隐窝干细胞，并通过推拉绒毛运动促进更长的绒毛和更深的隐窝，从而增加小肠的功能表面积。这种机制形成一个增强循环：改善的上皮结构促进更大的营养吸收，进而增强黏膜成熟和免疫功能。综上所述，这种机制性协同效应解释了本研究中观察到的绒毛长度、隐窝深度和饲料转化率的显著提升，并表明益生菌在维持家禽长期肠道健康方面的潜力。

在研究结果对家禽产业的影响方面，本研究为家禽产业提供了深远的启示。Pediococcus acidilactici作为益生菌的使用，可能成为家禽生产中抗生素的可行替代方案。通过增强免疫功能、生长性能和肠道健康，这种益生菌为维持生产效率提供了一个可持续的解决方案，同时减少了抗生素耐药性和食品链中残留物的全球问题。此外，益生菌提高疫苗效力的能力表明，它可能是家禽疫苗接种计划中的重要辅助手段，有助于改善健康状况和生产性能。随着消费者对无抗生素家禽的需求增加，将Pediococcus acidilactici等益生菌纳入家禽养殖实践，可能帮助满足这一需求，同时确保可持续的生产方式。

在研究的局限性和未来方向方面，尽管本实验取得了积极的结果，但仍存在一些值得注意的局限性。首先，实验没有使用活病毒挑战模型，这将更全面地评估益生菌的免疫保护潜力。其次，实验仅在生长阶段进行，未考虑长期影响或在育种鸡群中的表现。后续研究需要延长益生菌的使用时间，并评估其在整个生产周期中的效果。此外，虽然在矿物保留和骨骼矿化方面有所改善，但这些分子机制仍不明确。建议未来的研究使用先进的组学技术，如转录组学、蛋白质组学和代谢组学，以明确益生菌影响的靶向信号网络和相关基因网络。这些结果可以为矿物吸收、骨骼健康和免疫耐受的关键调节因子提供信息，并为益生菌的作用机制奠定基础。

在翻译性效果方面，这些发现必须在商业生产环境中得到确认。在真实家禽农场进行大规模田间试验，将有助于评估实际效果、经济价值和效果的一致性。这类研究对于巩固Pediococcus acidilactici作为经济可行、可扩展且非抗生素的解决方案，以提升现代养殖系统中家禽的健康和生产性能至关重要。