用于模型膜中受体介导的簇印记的乙二炔功能化糖类模拟物

《Macromolecular Rapid Communications》：Diacetylene-Functionalized Glycan Mimetics for Receptor-Mediated Cluster Imprinting in Model Membranes

糖类模拟物通过固体相位合成整合二炔基团，在GUVs中通过多价凝集素介导形成动态糖簇，紫外光固化后产生荧光聚合物网络，为研究细胞膜糖类相互作用提供新工具。

　　本研究聚焦于细胞膜表面的糖萼结构，这是一种由糖蛋白和糖脂组成的密集层，广泛参与细胞间的通讯、信号传递以及病原体识别等生物学过程。糖萼的某些组分能够自发地组织成膜微域，通过聚集糖蛋白和糖脂来增强糖-凝集素之间的相互作用。然而，研究这些动态系统在天然膜中的行为具有挑战性，因为它们的高度异质性和动态性使得解析变得复杂。为了解决这一问题，合成糖萼模拟物成为一种有价值的方法，用于再现这些复杂的相互作用。在本研究中，我们提出了一种含二乙炔基的多价糖模拟物，将其整合到巨单层囊泡（GUVs）中作为模型膜。我们展示了该新型模拟物的合成与应用，并通过一种兼容固相合成（SPPoS）的构建模块，实现了对序列定义、脂质化的糖模拟物中二乙炔基的定点引入。当这些糖模拟物被引入GUVs后，凝集素结合会促使糖模拟物聚集，将二乙炔基单元带入接近的区域。随后，通过紫外照射诱导聚合，形成具有荧光特性的聚二乙炔基簇，从而模拟细胞膜中受体介导的糖簇形成过程。这种方法使我们能够对糖簇的形成进行精确控制，并为研究多价糖-凝集素相互作用及其在膜微域组织中的作用提供了一个灵活的平台。通过稳定糖簇，该系统展示了在细胞信号传递研究中的巨大潜力。

糖萼结构的复杂性使得其在细胞膜中的动态行为难以直接研究。因此，合成糖萼模拟物成为一种替代手段，以简化研究条件并保留关键的生物功能。GUVs作为一种模型系统，因其能够模拟细胞膜的多种生物过程，如膜相分离、细胞粘附和受体组装，已被广泛用于研究膜结构和功能。我们之前的研究引入了一种能够模拟天然细胞膜中脂筏形成的糖萼模拟物，并通过固相合成方法构建了脂质化的糖模拟物，使其能够定位到GUVs中的液态无序（Ld）或高度有序（Lo）膜域中。通过观察凝集素与Lo域中的糖模拟物结合程度显著高于Ld域，我们进一步验证了脂筏在增强多价凝集素-糖相互作用中的关键作用。然而，这种模型系统中的糖分布主要由其固有的物理化学性质决定，因此无法准确捕捉由受体激活引起的动态重组过程。因此，引入由受体介导的动态糖簇可能进一步完善糖萼模拟物，使其更接近于天然膜中的动态响应和局部微异质性，同时，通过可控的共价固定，可以更好地分析糖簇形成的效应。

为了研究糖簇的形成和相互作用，研究人员越来越多地使用光交联剂，如二氮杂环丁烷、芳香族叠氮化物和苯基衍生物，这些交联剂在紫外照射下可以形成共价键，从而识别相邻分子之间的相互作用。例如，Yarravarapu等人通过酶促方法将二氮杂环丁烷修饰的唾液酸连接到细胞表面的糖上，以实现糖蛋白的光交联。然而，光交联剂在紫外照射下会与相邻分子形成共价键，这可能导致非特异性交联，掩盖我们感兴趣的特异性结合事件。此外，将光交联剂共价连接到糖结构上可能会阻碍凝集素的识别，从而限制糖相互作用的分析。

为了解决这些问题，Morigaki等人开发了一种含二乙炔基的磷脂（1,2-双（23-二炔基）-sn-甘油-3-磷酸胆碱，DynePC），用于在支撑脂质双分子层上生成共价固定的脂质图案。二乙炔基是一种共轭的1,3-二炔基，可以在适宜条件下通过紫外照射（254 nm）进行聚合，生成具有交替双键和三键结构的聚二乙炔，同时伴随着π系统延长所导致的强烈颜色变化。这种对光的响应性使得聚二乙炔成为一种理想的色度探针，许多研究使用头基修饰的二乙炔基作为特定金属离子或生物分子的色度传感器。二乙炔基的聚合需要其单体之间具有一定的空间排列，因此被称为拓化学聚合。次级相互作用，如疏水作用、氢键或π堆积，可以促进二乙炔基单体的适当排列。此外，二乙炔基在最佳堆积条件下更倾向于与相邻的二乙炔基反应，从而减少与相邻分子的非特异性交联。

在本研究中，我们借鉴了Morigaki等人的方法，但将其扩展到糖模拟物上，通过凝集素介导的糖簇印迹技术生成模式化的糖萼模拟物。我们开发了一种兼容固相合成的二乙炔基构建模块，并将其引入到脂质化的糖模拟物中。这一构建模块允许我们在GUVs中形成具有特定位置和密度的糖簇。我们首先通过固相合成方法合成了一种含二乙炔基的糖模拟物，随后将其引入GUVs，并在紫外照射下诱导聚合，形成具有荧光特性的聚二乙炔基簇。通过这种方法，我们不仅能够观察糖簇的形成过程，还可以对其进行固定和进一步分析，从而更准确地模拟天然细胞膜中的糖簇行为。

在合成过程中，我们选择了两种不同的构建模块：一种含羧酸基团，另一种含Fmoc保护的脂肪胺基团。通过将这两种模块在固相上进行偶联，我们能够构建出含二乙炔基的糖模拟物。这一方法不仅提高了合成效率，还保留了对糖模拟物进一步延长的可能性。此外，我们还测试了二乙炔基与铜(I)-催化的炔-叠氮环加成（CuAAC）反应的兼容性，确保其在后续的糖修饰过程中不会发生不必要的分解。通过这种策略，我们成功合成了两种不同的糖模拟物：Man4DA-Chol和Gal4DA-Chol，它们分别含有四价的甘露糖或半乳糖头基团，并通过胆固醇基团锚定在膜上。这些结构在合成后通过RP-HPLC-MS、1H-NMR和HR-ESI-MS进行了验证，确保其结构的正确性。

为了进一步研究这些含二乙炔基的糖模拟物在溶液中的自组装和聚合行为，我们选择了Man4DA-Chol作为模型分子。通过使用尼罗红作为荧光读数，我们确定了其临界胶束浓度（CMC）。这一结果表明，Man4DA-Chol在低浓度下能够形成胶束，而在更高浓度下则表现出更强的自组装能力。随后，我们分析了其在紫外照射下的聚合特性，发现其在照射后吸收和发射光谱发生了显著变化，这表明发生了光诱导的聚合。此外，通过透射电子显微镜（TEM）观察到，照射后的胶束保持了球形结构，而未照射的胶束在乙醇稀释后发生了形态变化，进一步验证了聚合对胶束结构的稳定作用。

在将这些糖模拟物引入GUVs后，我们通过荧光显微镜观察了凝集素与糖模拟物之间的结合行为。使用荧光标记的Con A和RCA分别与Man4DA-Chol修饰的GUVs进行孵育，发现Con A能够与Man4DA-Chol结合，而RCA则无法与Man修饰的GUVs发生相互作用。这一结果进一步验证了系统的特异性。此外，通过竞争抑制实验，我们发现即使使用多价的甘露糖抑制剂，也无法完全阻止Con A与Man4DA-Chol修饰的GUVs的结合，但显著降低了结合程度。这表明系统的高亲和力和特异性能够有效抵抗竞争性结合的影响。

通过紫外照射诱导的二乙炔基聚合，我们能够生成具有荧光特性的糖簇，从而模拟天然细胞膜中的糖簇形成过程。我们发现，在没有合适受体的情况下，二乙炔基无法进行拓化学聚合，而在引入Man特异性凝集素Con A后，糖模拟物在膜上发生多价聚集，从而诱导二乙炔基的聚合。这一过程形成了具有荧光特性的糖簇，我们称之为凝集素介导的糖簇印迹。此外，我们尝试通过单价糖分子、胰蛋白酶处理或EDTA螯合钙离子来解离Con A诱导的糖簇，但未能成功，这可能是因为多价相互作用的高亲和力和空间屏蔽效应。

综上所述，本研究提出了一种用于糖萼模拟物中糖簇形成和空间控制的灵活策略。我们相信这些新型的糖模拟物将成为研究动态凝集素-糖相互作用的重要工具，包括那些涉及宿主-病原体识别的过程。同时，通过分析预先形成的糖簇结构如何影响生物反应，我们能够更深入地理解糖萼在细胞信号传递中的作用。此外，该研究还展示了如何通过可控的共价固定来分析糖簇形成的效应，为未来在细胞膜结构和功能研究中的应用提供了新的思路。