基于生物信息学筛选骨关节炎凝血相关生物标志物及免疫浸润机制研究

《Hereditas》：Identification of coagulation-related biomarkers in osteoarthritis and immune infiltration analysis based on bioinformatics

本研究针对骨关节炎（OA）诊断标志物缺乏的问题，通过整合GEO数据库四个芯片数据集，结合多种机器学习算法筛选出FAP、CTSH、MMP1、MMP9、C6和MAFF六个凝血相关关键基因，构建了高精度诊断模型（AUC=0.922），并通过体外实验验证其表达。该研究首次系统揭示凝血-免疫轴在OA中的作用机制，为疾病诊断和治疗提供新靶点。

　　

当我们行走、奔跑或跳跃时，关节软骨默默承受着冲击与磨损。骨关节炎（Osteoarthritis, OA）这种常见的退行性关节疾病，正悄然影响着全球约7.6%的人口，尤其困扰着中老年群体。OA主要表现为关节软骨降解和慢性炎症，但其具体发病机制仍有许多未解之谜。近年来，研究人员发现炎症和免疫反应在OA病理生理过程中扮演核心角色，而凝血系统与免疫应答之间存在着密切的相互作用，这为探索OA与凝血途径的关联提供了理论框架。

尽管已有一些生物标志物如软骨寡聚基质蛋白（COMP）和趋化因子CCL2被提出用于OA研究，但它们仍受限于组织特异性不足的问题。凝血系统通过多种机制参与炎症调控，例如凝血酶可激活蛋白酶激活受体（PARs），调节炎症介质释放；接触激活途径中的因子XIIa和激肽释放酶既能促进凝血，又能放大炎症信号。在类风湿关节炎（RA）中，纤维蛋白原和D-二聚体等凝血因子已被确定为高凝状态的标志物，这暗示凝血异常可能与慢性关节疾病存在联系。

虽然直接证据有限，但OA中的血小板活化和促凝血介质释放已被认为会加重滑膜炎症和软骨降解。例如，凝血酶可切割并激活IL-1α，从而促进血小板生成和局部炎症反应，有效桥接与OA相关的凝血过程和免疫调节机制。这些发现促使研究人员思考：能否通过生物信息学方法揭示OA中免疫反应与凝血之间的相互作用？这正是本研究试图回答的核心问题。

为了探索这一科学问题，研究人员开展了一项系统的生物信息学分析结合实验验证的研究。他们从基因表达汇编（GEO）数据库获取了四个微阵列数据集（GSE55235、GSE55457、GSE77298和GSE82107），共包含103个样本（69个OA样本和34个正常对照）。通过svaR包进行批次效应校正后，使用limma包识别差异表达基因（DEGs），设定筛选标准为|log₂FC|≥1且调整后P<0.05。从分子特征数据库（MsigDB）获取凝血相关基因集，与DEGs取交集得到凝血相关DEGs。采用四种机器学习算法（LASSO、SVM-RFE、随机森林和逻辑回归）筛选关键基因，并通过CIBERSORT进行免疫细胞浸润分析。最后，通过体外实验使用IL-1β处理的人正常软骨细胞（C28/I2细胞）模拟OA环境，利用qRT-PCR和Western blot验证关键基因的表达。

研究首先成功整合了四个GEO数据集，经过批次效应校正后，PCA分析显示数据点分布更加紧凑，表明批次效应被有效消除。差异表达分析共鉴定出294个DEGs，其中194个上调，100个下调。功能富集分析显示这些基因在免疫炎症反应、细胞粘附分子、细胞骨架组织和趋化因子信号通路等方面显著富集。特别值得注意的是，GSEA分析显示DEGs在HALLMARK_COAGULATION基因集中显著富集，提示OA与凝血过程存在强关联。

凝血相关基因分析发现9个与OA相关的凝血相关DEGs，包括FAP、TSPAN8、CTSH、MAFF、MMP1、MMP3、MMP9、TIMP1和C6。蛋白互作网络显示这些基因间存在密切相互作用，相关性热图揭示MMP家族成员（MMP1、MMP3、MMP9）间呈正相关，而MAFF、TSPAN8和C6与其他基因主要呈负相关。

通过四种机器学习算法的一致性筛选，研究人员最终确定了六个关键凝血相关OA基因（CROGs）：FAP、CTSH、MAFF、MMP1、MMP9和C6。这些基因在训练队列中表现出优异的诊断性能，单个基因的AUC值在0.782-0.843之间。基于这些基因构建的列线图模型AUC达到0.922，显示出极高的诊断价值。

免疫浸润分析揭示了OA滑膜组织中免疫细胞组成的显著变化。与正常组相比，OA组中M0巨噬细胞、浆细胞和γδT细胞比例升高，而活化的肥大细胞和静息记忆CD4⁺T细胞减少。这种免疫细胞浸润特征的改变为理解OA的免疫病理机制提供了新视角。

最令人信服的是实验验证结果。通过qRT-PCR和Western blot分析IL-1β处理的软骨细胞，发现FAP、MMP1、CTSH和MMP9的表达显著上调，而MAFF和C6明显下调，这与生物信息学分析结果高度一致，证实了这六个基因在OA病理过程中的关键作用。

研究团队在讨论部分提出了一个可能的机制框架：OA中的凝血相关基因可能通过NF-κB/NLRP3信号通路与免疫细胞活性相互作用。炎症细胞因子如IL-1家族成员可激活NF-κB信号级联，诱导VEGF和FGF产生，促进包括TNF-α和IL-1β在内的各种促炎基因表达，进而触发下游反应如MMP1和MMP9的上调。NF-κB通路在调节T细胞分化和效应功能中起关键作用，这可能解释本研究中观察到的免疫细胞浸润特征变化。

值得注意的是，FAP的上调提示其可能参与纤维化过程，而过度的纤维化可能导致异常细胞外基质沉积，进而激活凝血途径。炎症信号分子（如纤维蛋白原）在凝血过程中释放，可能激活PARs，促进细胞因子、趋化因子和粘附分子等促炎介质的释放，进一步加剧炎症反应和凝血级联。

这项研究的创新之处在于首次系统探讨了凝血相关基因在OA中的作用，并采用多种机器学习算法筛选出可靠的诊断标志物。六个关键基因中，FAP作为成纤维细胞活化蛋白，具有胶原酶活性，能降解II型胶原；MMP1和MMP9是基质金属蛋白酶家族成员，参与细胞外基质降解；CTSH参与抗原呈递和蛋白降解；C6是膜攻击复合物（MAC）的重要组成部分；MAFF作为转录因子，可能在细胞分化中发挥作用。

研究的局限性包括回顾性设计、样本量相对较小、以及仅使用单一软骨细胞系进行验证。未来需要在原代软骨细胞、动物模型和更大临床样本中进一步验证这些发现，并深入探索这些基因的上游调控机制和下游信号通路。

综上所述，这项发表在《Hereditas》上的研究通过整合生物信息学、机器学习和实验验证，首次系统识别了FAP、CTSH、MAFF、MMP1、MMP9和C6这六个OA相关的凝血相关生物标志物，揭示了凝血-免疫轴在OA发病机制中的潜在作用。这些发现不仅为OA的早期诊断提供了新的分子标志物，也为开发针对凝血-免疫相互作用的新型治疗策略奠定了理论基础，具有重要的临床转化价值。