在轻度低温条件下，对中国仓鼠卵巢细胞内内质网应激反应的蛋白质组学及泛素化蛋白质组学研究

《Biotechnology and Bioengineering》：Proteomic and Ubiquitinated Proteome Insights Into ER Stress Responses in Chinese Hamster Ovary Cells Under Mild Hypothermic Conditions

研究通过质谱蛋白质组学分析，发现31℃低温培养导致CHO细胞糖基化相关蛋白（如DDOST、P4HB、PRKSCH、LMAN1）下调，引发内质网应激（ER stress）。通过泛素化蛋白质组学进一步揭示，低温下泛素化蛋白降解途径（ERAD）增强，并激活未折叠蛋白反应（UPR）。实验表明，低温通过调控泛素化蛋白降解和ER应激响应机制，在保持细胞存活率的同时提升重组蛋白产量。不同CHO细胞系（如CHO-K1、CHO-DP12、CHO-SK15-EPO）对低温的响应存在差异，尤其在eIF2α和PERK信号通路中表现出适应性调节。本研究为优化CHO细胞低温培养工艺提供了新的分子机制依据。

　　在生物制药领域，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞因其高效生产重组蛋白的能力而被广泛使用。这些细胞能够模拟人类细胞的后翻译修饰过程，从而生产出具有人类生物活性的蛋白质。然而，在细胞培养过程中，CHO细胞会经历多种应激因素，这些因素可能影响蛋白质的表达、折叠以及在内质网（ER）中的功能。轻度低温（如31°C）已被广泛应用于CHO细胞的生物制药生产中，以提高重组蛋白的产量和质量。尽管如此，关于低温对ER相关通路的具体影响，特别是涉及蛋白质折叠和应激反应的机制，仍存在许多未知之处。

本研究通过基于质谱的蛋白质组学技术，深入分析了CHO细胞在轻度低温（31°C）条件下的全细胞蛋白质组和泛素化蛋白质组变化。研究重点聚焦于ER蛋白和ER应激反应。通过高分辨率质谱分析，我们量化了低温条件下蛋白质丰度和泛素化肽的变化，揭示了细胞在低温下的生理适应机制。研究发现，CHO细胞在31°C时，多个与新生多肽糖基化相关的蛋白质（如DDOST、P4HB、PRKSCH和LMAN1）表达下调，这表明低温可能干扰细胞正常的蛋白质折叠能力，导致ER应激。然而，这种应激反应同时伴随着细胞存活率的维持和生产率的提高，说明ER应激反应在一定程度上能够缓解因折叠异常而导致的蛋白质毒性。

此外，研究还发现，转录因子eIF2α在非生产型细胞中表达下调，而在生产型细胞中表达上调，这提示生产型CHO细胞可能具有更强的适应性应激反应，从而在低温条件下更有效地维持其功能。泛素化肽的增加表明，细胞可能依赖ER相关降解（ERAD）途径来清除受损蛋白，以减轻蛋白质毒性。泛素化不仅调节蛋白质降解，还影响蛋白质的稳定性与功能，为细胞应对应激提供了更精细的调控机制。

本研究进一步揭示了泛素化在CHO细胞低温应激中的关键作用。泛素化蛋白质组的富集分析显示，多个与蛋白质定位、细胞组织和能量代谢相关的通路在低温条件下发生变化。例如，在低温条件下，与蛋白质定位相关的功能显著增强，这可能与细胞重新组织其内部机制以应对应激有关。泛素化在这些过程中的作用，提示了其在维持细胞稳态中的重要性。

在ER折叠相关通路中，多个关键蛋白的表达下调，如SEC61A1、LMAN1、ERP29等，这可能与低温条件下蛋白质折叠能力的降低有关。这些蛋白的下调表明，细胞在低温下可能减少了对某些折叠过程的依赖，转而通过泛素化途径来处理异常蛋白。而在ERAD通路中，多个泛素相关蛋白的表达上调，如NSFL1C、UBXD2、UBQLN2和STUB1，这表明细胞在低温条件下可能增强了对异常蛋白的清除能力。这种增强的清除机制有助于细胞维持其蛋白质质量，防止细胞凋亡。

在未折叠蛋白反应（UPR）通路中，多个关键蛋白如EIF2S1和PDIA6的表达变化提示了细胞对异常蛋白积累的响应。EIF2S1的上调可能与细胞通过减少整体蛋白质合成来应对应激有关，而PDIA6的下调则可能与抑制IRE1α的激活有关，从而影响UPR的启动。这些发现不仅揭示了低温条件下CHO细胞的适应机制，还为优化生物制药生产策略提供了新的思路。

本研究的成果表明，泛素化在CHO细胞低温应激反应中扮演了至关重要的角色。通过分析泛素化蛋白组的变化，我们发现这些蛋白在多种生物过程中被调控，包括蛋白质定位、细胞组织和代谢。此外，泛素化在ER应激反应中的作用不仅限于蛋白质降解，还可能涉及蛋白质的定位调控和功能调整。这种多层次的调控机制，使细胞能够在应激条件下维持其功能，同时避免细胞凋亡。

研究还发现，不同细胞系在低温条件下的应激反应存在差异。例如，非生产型细胞CHO-K1在低温下表现出较强的泛素化反应，而生产型细胞CHO-SK15-EPO和CHO-DP12则表现出不同的适应策略。这些差异可能与细胞系的基因工程改造有关，例如不同细胞系可能在基因整合、表达调控等方面存在差异，从而影响其对低温的反应。

此外，研究还指出，泛素化可能通过调控蛋白质的定位和功能，影响细胞的整体应激反应。例如，GJA1蛋白在低温条件下表现出不同的表达模式，这可能与其在细胞间信号传导中的作用有关。同时，PLAA蛋白在低温下的表达变化可能与其在蛋白质泛素化和降解中的作用有关。这些发现为未来CHO细胞的基因工程提供了新的靶点，可能有助于提高其对低温的适应能力，从而优化生物制药生产。

综上所述，本研究通过深入分析CHO细胞在低温条件下的蛋白质组和泛素化蛋白质组变化，揭示了低温对细胞应激反应的复杂影响。这些发现不仅有助于理解CHO细胞的适应机制，还为优化生物制药生产策略提供了新的视角。未来的研究可以进一步探索泛素化在不同细胞系中的具体作用，以及如何通过基因工程手段增强细胞的适应能力，从而提高生物制药的产量和质量。