敲除Ligase4基因可提高Plutella xylostella（小菜蛾）中的同源定向修复效率

《Insect Science》：Knockout of Ligase4 gene enhances homology-directed repair efficiency in Plutella xylostella

抑制鳞翅目昆虫DNA连接酶4（LIG4）可显著提升CRISPR/Cas9同源定向修复效率，为提高农业害虫基因编辑效率提供新策略。

　　

摘要

由于非同源末端连接（NHEJ）途径的占主导地位，基于CRISPR/Cas9的同源定向修复（HDR）在鳞翅目昆虫中的敲入效率较低。DNA连接酶4（LIG4）是NHEJ复合体的核心蛋白，也参与双链断裂（DSB）的修复，是提高多种物种HDR效率的有希望的目标。然而，Lig4在调节蔬菜害虫Plutella xylostella中HDR效率的作用仍不清楚。从P. xylostella基因组中鉴定出了PxLig4基因，该基因包含4个保守结构域：ATP依赖的DNA连接酶核心-腺苷化中间结构域、ATP依赖的DNA连接酶核心-腺苷化N端结构域、ATP依赖的DNA连接酶核心-腺苷化C端结构域以及BRCA1 C端结构域。多重序列比对和系统发育分析证实了PxLig4在鳞翅目昆虫中的高度保守性。实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析显示，PxLig4在卵、雌性成虫和雄性成虫中表达丰富，尤其是在卵巢中，其次是睾丸、脂肪体和肠组织。利用CRISPR/Cas9技术成功构建了一个具有2个碱基对缺失的PxLig4纯合敲除系（ΔPxLig4）。ΔPxLig4表现出明显的发育和生殖缺陷。为了评估敲入效率，开发了一种供体载体，用于将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因敲入眼色基因PxKmo中。ΔPxLig4的敲入效率为2.86%，显著高于野生型P. xylostella的0.26%。这些结果表明Lig4是NHEJ过程中的辅助因子，并证明抑制PxLig4可以提高P. xylostella中的HDR效率，为提高昆虫害虫的基因敲入效率提供了潜在策略。

利益声明

作者声明没有利益冲突。