卟啉连接的抗真菌纳米载体通过激活UV抗性基因座8介导的光信号传导来促进植物生长

《Plant Biotechnology Journal》：Porphyrin-Linked Antifungal Nanocarrier Promotes Plant Growth via UV RESISTANCE LOCUS 8-Mediated Light Signalling Activation

农药递送载体与植物生理调控机制研究：基于共价有机框架（COF）的Fludioxonil纳米系统在烟草中的效应及分子机制

　　随着全球气候变化和病虫害威胁的加剧，农业生产面临着前所未有的挑战。为了满足不断增长的人口对粮食的需求，提高作物产量并发展更高效的植物保护技术变得尤为迫切。传统的化学农药虽然在控制植物病害方面具有成本低、使用方便等优势，但其利用效率却十分有限。据统计，每年全球农业用地和温室中施用的农药超过500万吨，然而仅有不到0.1%的活性成分能够到达土壤中的病原体，其余大部分残留在环境中，对非目标生物造成危害，破坏微生物群落，甚至引发生态失衡。此外，农药残留还对食品安全和人类健康构成潜在风险，如内分泌干扰、致癌性和生物多样性丧失等问题。因此，开发更高效且环境友好的作物保护策略成为当前农业可持续发展的关键。

在这一背景下，纳米技术为农业提供了一种具有前景的解决方案。纳米载体能够实现农药的控制释放和靶向输送，从而提高吸收效率、延长活性物质的作用时间，并增强其生物活性。这种技术不仅提高了病害控制效果，还有效减少了对非目标生物的不良影响。相比传统农药，纳米载体可以保护活性成分免受提前降解，促进其渗透植物组织，并在土壤和叶片中实现更均匀的分布。近年来，多种类型的纳米载体已被开发，包括聚合物纳米颗粒、脂质载体以及如壳聚糖等生物聚合物系统，这些载体表现出更高的稳定性和更低的植物毒性。一些基于纳米载体的农业化学品甚至已进入试点商业化阶段，尽管其规模化生产、监管接受度和长期生态安全性仍存在争议。

除了提高农药利用效率，纳米载体还可以直接调控植物的生理和生化过程。例如，石墨烯量子点（GQDs）能够显著提高烟草的生物量和叶绿素积累，同时激活如NtLRX1、CycB和NtPIP1等基因。氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）则能够提升油菜和茶树的光合作用效率、营养积累和抗氧化酶活性。磁性氧化铁纳米颗粒（Fe?O? NPs）通过重新编程氨基酸代谢，促进根系发育和营养吸收。类似地，金属-有机框架（MOFs）可用于控制微量元素释放并调节植物代谢网络。这些研究共同表明，纳米载体不仅能克服传统农药的局限性，还具有增强植物活力的潜力，显示出其在作物保护和植物生长促进方面的双重作用。

鉴于其高稳定性、结构可调性和良好的生物相容性，共价有机框架（COFs）逐渐成为农药载体的热门选择。COFs作为高度可调和结构可编程的有机纳米平台，展现出强大的控释和靶向输送能力。其氮丰富的孔壁与农药分子之间通过氢键和非共价作用形成强相互作用，从而赋予其出色的载药能力和对生物刺激的响应性。与MOFs相比，COFs不含重金属，这降低了其毒性并提升了环境安全性。特别是含有卟啉结构的COFs，由于卟啉单元赋予其独特的光活性和电子特性，因此引起了广泛关注。卟啉在自然界中以其光捕获能力、电子传递能力和参与光合作用与光形态建成等生物过程而闻名。将卟啉引入COFs中，可能为这些材料提供额外的功能，使其不仅能够作为农药载体，还能通过影响植物信号传导网络来增强植物生长。尽管这些特性使COFs在农业应用中展现出巨大潜力，但目前对其通过信号传导或基因表达途径调控植物生理的能力仍缺乏深入理解。虽然已有研究显示某些纳米材料如GQDs或ZnO NPs可以激活激素信号通路和光合作用相关基因，但尚未有研究明确证实COFs是否在分子层面具有类似的调控作用。尤其是，COFs是否通过UV RESISTANCE LOCUS 8（UVR8）介导的信号级联影响植物生长，这一问题尚未得到解答。填补这一空白对于理解纳米载体特性与植物发育途径之间的机制联系至关重要。

由Fusarium oxysporum引起的根腐病是土壤传播病害中的一大威胁，特别是在根际环境中。在本研究中，选择了Fludioxonil（FLU）作为目标化合物，以开发基于纳米载体的农药输送系统。FLU的作用机制通常与渗透压应激信号通路的紊乱有关，此外，一些研究还表明，其对线粒体呼吸的抑制也可能对其抗真菌活性有所贡献。除了评估其抗真菌效果外，本研究还考察了该系统对植物性能的增强能力，通过调控生理和代谢通路来实现。基于卟啉连接COFs的结构和功能特性，我们假设该系统能够同时增强抗真菌活性、减轻生态毒性并促进植物生长，通过影响植物内源信号传导过程。特别是，我们推测UVR8介导的信号轴可能在COF诱导的生长反应中起关键调节作用。因此，本研究系统地评估了FLU@COF的抗真菌活性和生物相容性，探究了其对植物生理和代谢的影响，并阐明了其潜在的分子机制，重点聚焦于UVR8信号通路。通过将农药输送、植物生长促进和分子机制分析相结合，本研究旨在推动多功能纳米载体在可持续农业中的发展。

为了评估FLU@COF的结构组成和物化性质，我们进行了多方面的表征分析。透射电子显微镜（TEM）显示，所合成的COF纳米颗粒具有近似球形的形态，表面光滑且尺寸分布狭窄。动态光散射（DLS）测量表明其平均粒径为56纳米，这表明其合成过程受到良好控制，且具有优异的分散性。X射线光电子能谱（XPS）分析显示，碳和氮是主要元素，且没有明显的杂质峰，表明其纯度较高。高分辨率N 1s光谱显示N=C和N–C峰，而C 1s光谱则确认了芳香碳、C–NH?、三嗪碳和C=O信号的存在，进一步验证了其丰富的官能团。紫外-可见光谱（UV-Vis）显示，其在420纳米处有Soret带，在500至650纳米处有Q带峰，这是卟啉环的典型特征。在负载农药后，TEM确认了FLU@COF纳米颗粒保持了其形态，而DLS显示其尺寸增加至81纳米，表明成功封装而未影响其分散性。氮气吸附-脱附等温线（N?吸附）显示其呈现类型IV曲线，BET比表面积为348平方米/克，但负载后比表面积下降至304平方米/克，这表明部分孔隙被农药占据。X射线衍射（XRD）图谱显示，在2θ=6.3°处有衍射峰（COF），负载后该峰略有偏移至6.45°，但未检测到结晶FLU的峰，表明其在框架中以非晶态形式存在。傅里叶变换红外光谱（FTIR）光谱显示，其保留了咪唑连接框架的特征C=N伸缩振动峰（1827厘米?1），以及三嗪环的吸收峰（1492、1284和1081厘米?1）。值得注意的是，负载后C=O峰（1732厘米?1）和N–H峰（3236厘米?1）显著减弱，同时在1653厘米?1处出现新的吸收峰。这些光谱变化表明FLU与COF之间存在强烈的主客体相互作用，以及孔隙限制和物理吸附现象。然而，虽然光谱偏移可能暗示了可能的羰基或氨基相互作用，但目前尚无明确证据证明形成了新的共价Schiff碱键。热重分析（TGA）显示其热稳定性与原始COF相当，在氮气气氛下分解起始温度约为410°C。负载效率为60.9%，负载含量为17.0%。这些结果表明，COF纳米颗粒具有良好的尺寸控制、高纯度和优异的光学稳定性。但本研究的一个局限性是，尽管光谱变化可能暗示了潜在的相互作用，但尚无确凿证据证明新的共价键形成，因此仍需进一步的机制研究。

为了进一步评估FLU@COF在土壤中的迁移行为和稳定性，我们设计了土壤柱实验。Fusarium oxysporum是一种常见的土壤传播病原菌，对农业生产构成了重大挑战。传统农药常因漂移、淋溶和快速降解等问题而难以精确输送至根际区域。FLU@COF系统通过提升迁移能力和持久性来克服这些限制。在施药后，我们通过测量不同土壤深度和横向区域的残留FLU浓度来评估其迁移行为。结果显示，FLU@COF在深层土壤（第3层）和远距离横向区域（Lap3）中均能保持可检测的浓度（9.4毫克/千克），而自由FLU则在这些位置无法检测到。这些数据表明，FLU@COF具有优异的垂直渗透能力和水平扩散能力，使其能够更广泛地分布在根际区域。

吸附-解吸实验进一步揭示了FLU@COF在土壤界面的特殊行为。与自由FLU相比，FLU@COF表现出更低的吸附率和更高的解吸率，表明其与土壤成分的结合能力较弱。这一特性有利于维持活性成分在土壤中的移动性和生物可利用性，从而增强其对目标区域的可达性。降解动力学实验显示，自由FLU在10天后降解至初始浓度的24.3%，而FLU@COF在25天和60天后仍能保留67.8%和14.4%的FLU浓度，表明其在土壤条件下的持久性显著提高。这些结果表明，FLU@COF系统能够有效提升FLU的迁移能力和稳定性，从而在根际区域实现更广泛的局部积累和更持久的释放。然而，这些土壤柱实验虽然验证了其良好的持久性，但受限于实验室环境的可控性，长期的田间试验对于评估其在异质土壤和动态环境下的稳定性至关重要。

在体外抗真菌实验中，我们评估了FLU@COF的抗真菌效果。通过平板抑制实验和盆栽实验，我们比较了不同处理对Fusarium oxysporum的抑制作用。平板实验中，对照组和COF组的菌落生长速度较快，表明原始COF不具备固有的抗真菌活性。而含有金属axyl-M和自由FLU的处理表现出中等抑制效果，相比之下，FLU@ES（一种广泛使用的商业制剂）和FLU@COF则显示出显著增强的抑制能力，其中FLU@COF的效果最强。定量分析显示，COF组的EC50值（抑制50%菌落生长所需的浓度）最高，表明其效果微乎其微。而FLU@COF的EC50值最低，分别达到14.3微克/毫升（菌丝）和1.2微克/毫升（孢子），显著低于FLU@ES的19.3和1.6微克/毫升（p < 0.01）。盆栽实验进一步支持了FLU@COF的卓越效果。对照组和COF组的植株表现出严重的病害症状，包括生长受阻和根部腐烂。而含有金属axyl-M和自由FLU的处理虽然改善了地上部分的健康状况，但其根部仍显示出感染迹象。FLU@ES提供了中等程度的病害控制，而FLU@COF则表现出最强大的保护效果，植株生长旺盛，叶片深绿色，根部健康。统计分析显示，FLU@COF在5和50微克/毫升浓度下将病害发生率分别降低至13.1%和0.9%，显著优于对照组的95.4%。这些结果表明，FLU@COF在抗真菌效果、病害控制能力和植物毒性方面均优于现有制剂。然而，这些盆栽实验是在温室的控制条件下进行的，为了验证其在不同环境下的效果和安全性，需要进行更大规模的田间试验。

在植物体内迁移和生长促进方面，我们进一步研究了COF纳米颗粒的行为。之前的结果表明，高浓度的FLU@COF不仅缓解了植物毒性，还抑制了病原菌的感染，从而增强了植物的抗病能力。为了深入探讨其在植物体内的动态，我们评估了COF纳米颗粒在组织中的迁移和植物生理反应。使用共聚焦激光扫描显微镜，我们观察到了COF在根部和叶部组织中的荧光信号，表明其能够成功穿透根部表皮屏障并进入内部细胞结构。此外，我们还检测到了叶部组织中的强烈荧光信号，这可能表明其通过木质部驱动的运输机制实现向上的系统性传播。这些结果证实了COF纳米颗粒从根部向地上部分的系统性迁移。这种迁移机制可能通过木质部驱动的水分和营养流动实现，与之前关于纳米材料在植物体内迁移的研究结果一致。

为了进一步评估COF纳米颗粒对植物生长的影响，我们在不同浓度（0、10和50毫克/升）下进行实验。高浓度COF处理（50毫克/升）显著增加了叶面积（+37.4%）和植株高度（+25.2%），相较于对照组表现出显著的生长促进效果（p < 0.01）。然而，在茎粗和根长方面未观察到显著差异（p > 0.05）。生理分析显示，叶绿素a和b的含量分别增加了25.0%和37.5%。元素分析表明，碳（C）和氮（N）的积累分别增加了23.1%和54.2%。此外，激素水平也显著上升，包括生长素（IAA）增加了22.3%，细胞分裂素（CK）和赤霉素（GA）也分别表现出增加趋势。可溶性糖含量也提高了34.9%。这些结果表明，COF纳米颗粒通过增强色素合成、营养积累和激素调控，促进了植物生长，并伴随着其在植物体内的系统性迁移。

为了阐明COF纳米颗粒促进植物生长的分子机制，我们进行了整合的转录组和代谢组分析，从基因表达和代谢调控的角度系统地研究了植物对COF处理的反应。转录组分析揭示了基因表达的广泛重编程。主成分分析（PCA）显示，不同处理组之间存在明显的分离，且组内具有良好的可重复性。火山图分析识别出大量差异表达基因（DEGs），显示出显著的调控。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析表明，这些DEGs主要与光合作用、碳和氮代谢以及激素信号传导相关。值得注意的是，有78个核心基因被鉴定为调控色素合成、蛋白质加工和植物发育的功能模块的关键组成部分。

代谢组分析进一步揭示了COF纳米颗粒的调控作用。PCA结果显示，不同处理组之间存在明显的聚类。差异代谢物分析表明，代谢物丰度呈现出剂量依赖性变化。通路富集分析显示，半胱氨酸和蛋氨酸代谢被显著激活，这些代谢过程与蛋白质合成、氧化还原平衡和细胞活性密切相关。整合转录组-代谢组分析揭示了COF处理组中光信号通路的显著富集。其中，UV-B光受体基因UVR8被持续上调，表明其在COF介导的反应中起关键作用。之前的研究表明，当UVR8感知UV-B辐射时，它会激活COP1-SPA复合体，进而稳定关键转录因子HY5。这一过程最终调控了光响应基因的表达，包括WRKY转录因子41、B-box锌指蛋白和脂肪酸脱饱和酶（FAD）。定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）验证了这一信号轴的激活，显示出UVR8、HY5及其相关靶基因的一致上调。这些多组学结果表明，COF纳米颗粒通过调控基因表达和代谢通路来增强植物生长，其中UVR8介导的光信号传导成为关键调控枢纽。然而，尽管多组学数据提供了强有力的关联证据，进一步的功能研究仍需进行，以明确COF暴露与UVR8通路激活之间的因果关系。

为了验证UVR8在COF纳米颗粒介导的植物反应中的作用，我们采用了病毒诱导基因沉默（VIGS）策略。通过构建pTRV2-UVR8重组载体，并在烟草植株中特异性沉默UVR8基因，我们观察到其在10天后表现出轻微的生长抑制，qRT-PCR分析证实其转录水平显著降低，验证了VIGS系统的有效性和特异性。在同时施用COF和UV-B照射的条件下，UVR8的表达被显著上调，这表明UVR8在COF诱导的调控反应中起关键作用。在UV-B照射下，UVR8的缺失显著干扰了下游光信号传导通路。在UVR8缺陷植株中，COP1和其共因子SPA的表达显著上调，而关键的转录因子HY5则被明显抑制。进一步分析显示，与细胞分裂和发育相关的WRKY41、参与光-激素相互作用的BBX以及与脂质代谢和细胞膜稳定性相关的FAD基因表达均显著下调。相比之下，在非UV-B条件下，UVR8缺陷植株（?uvr8）与对照组（?UVR8）在基因表达、代谢特征和表型方面没有显著差异。这些转录水平的变化在生理层面也得到了体现，?uvr8植株在UV-B照射下表现出生长素（IAA）、细胞分裂素（CK）和赤霉素（GA）水平的显著下降，以及叶绿素a和b含量的明显减少。这些结果表明，UVR8在调控植物生长和光信号传导中起着关键作用，同时其缺失会干扰这些过程。

在安全性评估方面，我们采用了多种方法来验证FLU@COF对非目标生物的毒性。细胞毒性实验显示，FLU@COF在浓度范围5至200纳米摩尔之间对U343细胞（一种人胶质瘤细胞系）的毒性极低，所有样本均维持在等级I的细胞活力水平。在更高浓度（1600纳米摩尔）下，细胞活力略有下降至84.3%，但仍处于可接受的安全阈值内。在斑马鱼胚胎的急性毒性测试中，FLU在0.2至0.8毫克/升浓度下的半数致死浓度（LC50）分别为0.3和0.5毫克/升，而COF和FLU@COF的LC50值分别为1193.7至966.7毫克/升和743.3至804.6毫克/升，这表明COF纳米载体系统有效降低了FLU的环境毒性。对于成年斑马鱼，10条鱼每组在相同处理溶液中暴露，记录其在48和96小时内的死亡情况。对于蚯蚓，每组约20只个体被引入经过FLU、COF或FLU@COF处理的土壤容器中。土壤湿度维持在田间持水量的60%，容器在黑暗条件下培养15°C。在第7天和第14天记录死亡情况。这些实验结果表明，FLU@COF的毒性显著低于自由FLU，显示出其良好的环境兼容性。需要指出的是，U343细胞系仅作为生物相容性的一般参考，而更具农业相关性的安全性评估则通过无脊椎动物（蚯蚓）和水生生物（斑马鱼）模型进行，这些模型提供了更有力的环境兼容性证据。然而，为了全面评估COF对非目标生物的长期影响，特别是对水生生态系统和食物链的潜在风险，进一步的研究仍然需要。

本研究的实验数据通过稳健的统计方法进行了分析，所有结果均以平均值±标准误（mean ± SE）表示，除非另有说明，生物重复为3次。为了评估不同处理组之间的差异，我们进行了单因素方差分析（ANOVA），并采用邓肯多重比较法作为事后检验，统计显著性设定为p < 0.05，高度显著差异为p < 0.01。所有分析均使用SPSS 17.0和GraphPad Prism 8.0进行，结果以带误差线的柱状图形式呈现，确保了数据的可视化和统计比较的清晰表达。

为了支持本研究的发现，RNA-seq数据已被存入NCBI SRA数据库，生物项目编号为PRJNA1231271，生物样本编号为SAMN47205978–SAMN47205986，研究编号为SRP568209。对应的SRA运行编号为SRR32583491–SRR32583483。代谢组数据则存入MetaboLights数据库，编号为MTBLS12302。该数据集目前正处于整理阶段，可通过以下链接获取：https://www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS12302。