阴离子/阳离子转运的紊乱通过破坏钙离子（Ca2+）的稳态，导致水稻顶端穗的脱落

《Plant Biotechnology Journal》：Perturbation of Anion/Cation Transport Leads to Apical Panicle Abortion in Rice by Disrupting Ca2+ Homeostasis

钙离子转运蛋白PAA2通过协调OsUBC45模块维持水稻花药顶端钙稳态。摘要：水稻PAA2属于NPF家族转运蛋白，通过等离子体膜和内质网定位，与VAMP727相互作用介导钙离子逆向运输。过表达PAA2导致花药顶端钙积累、氧化应激和程序性死亡，突变体paa2则表现为顶端花药坏死。PAA2与OsUBC45形成E3连接酶复合体，调控钙离子运输平衡。钙梯度在花药伸长至13厘米时形成，与PAA2高表达阶段一致，而OsUBC45缺失导致梯度异常。该研究揭示了PAA2-OsUBC45模块在钙稳态调控中的关键作用。

　　钙离子（Ca2?）是植物生长发育过程中不可或缺的营养元素，不仅参与细胞结构的形成，还作为细胞内重要的信号分子，调控植物对环境刺激的响应。植物通过根系从土壤中吸收钙离子，并通过木质部将其运输至地上部分。这一过程需要精确调控，以防止钙离子在细胞内过度积累。然而，目前对钙离子稳态调控机制的研究仍不充分。本研究通过鉴定一个NITRATE TRANSPORTER1/PEPTIDE TRANSPORTER家族（NPF）成员PAA2的增效突变体，揭示了其在水稻穗发育过程中对钙离子的运输功能及其调控机制。

水稻穗是一种有限生长的花序结构，其形成始于茎顶的分生组织，在从营养生长向生殖生长过渡的过程中逐渐发育。穗的形成过程包括顶部分生组织细胞的分裂与扩展，随后形成初级枝、次级枝和侧生小穗的分生组织。在穗长度小于4厘米时，主要完成分化阶段，之后进入快速伸长和生殖器官成熟阶段。钙离子在水稻穗发育中的作用已被广泛研究，例如，OsCIPK31基因突变会导致过量活性氧（ROS）积累，最终引发穗顶端小穗的退化，而OsCAX1a基因突变则导致钙离子缺乏，造成小穗退化。这表明钙离子在维持穗正常发育中具有关键作用。

研究发现，水稻穗在发育过程中呈现出一种类似于单细胞中极性生长模式的钙离子梯度。这种梯度从穗的顶端向基部延伸，类似于根毛和花粉管的钙离子分布模式。然而，目前尚不清楚多细胞组织如快速发育的年轻穗是否也存在类似的钙离子梯度。此外，钙离子在植物体内的长距离运输机制仍然不明，通常认为其被动运输过程是由蒸腾作用驱动的，而植物通过细胞膜上的转运蛋白实现电中性平衡。

PAA2属于OsNPF7.9家族，与拟南芥中的AtNRT1.5/AtNPF7.3和AtNRT1.8/AtNPF7.2高度同源。研究表明，PAA2是一种低亲和力硝酸盐转运蛋白，参与氮素从根部向地上部分的再分配。考虑到PAA2可能参与钙离子的运输，我们通过转基因技术检测了过表达PAA2的水稻植株（ZH11）中的营养元素浓度。结果显示，过表达PAA2的植株中氮素积累显著增加，同时穗中多种阳离子（如钙、镁、锰、钾、钠和锌）也出现了过量积累现象。这些结果提示，PAA2在钙离子运输中可能具有重要作用。

为了进一步验证PAA2是否能够直接运输钙离子，我们使用两电极电压钳技术（TEVC）在非洲爪蛙（Xenopus laevis）卵母细胞中进行实验。PAA2表达的卵母细胞在钙离子溶液中表现出显著的内向电流，且电流强度随外部钙离子浓度的增加而增强。此外，使用钙离子通道阻断剂LaCl?和钙螯合剂EGTA处理后，电流被抑制，这表明PAA2确实参与钙离子的运输。进一步实验还发现，PAA2能够运输钠、钡、钾和镁等其他阳离子，说明其在植物体内可能具有广泛的离子运输功能。

为了研究PAA2在穗发育过程中对钙离子稳态的调控作用，我们对过表达PAA2的植株（ZH11）和野生型（GSHD）进行了钙离子浓度的纵向测量。结果显示，在穗长度小于5厘米时，钙离子主要集中在穗的基部，随着穗的发育，钙离子逐渐向顶端迁移，形成一种顶端聚焦的钙离子梯度。这种梯度在穗长度达到7厘米以上时尤为明显，但在穗形成阶段（约13厘米）后逐渐消失。这表明，PAA2在维持钙离子梯度方面发挥了重要作用。

进一步研究发现，PAA2在细胞膜、内质网（ER）和前液泡区室（PVC）中定位，并与VAMP727（一种囊泡相关膜蛋白）共定位。这一结果提示PAA2可能通过囊泡运输机制参与钙离子的跨细胞运输。此外，PAA2与OsUBC45蛋白相互作用，OsUBC45是一种E2泛素连接酶，可能参与PAA2的泛素化修饰和降解过程。通过构建PAA2和OsUBC45的敲除突变体，我们发现OsUBC45在维持钙离子稳态中具有重要作用。特别是在穗形成阶段，PAA2与OsUBC45的协同作用对于维持钙离子梯度至关重要。OsUBC45的缺失会导致钙离子在穗顶端的过度积累，而PAA2的过表达则导致类似的钙离子异常现象，从而引发穗顶端的退化。

为了进一步探索PAA2在钙离子稳态中的作用，我们进行了多种实验分析，包括透射电镜（TEM）和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）实验。这些实验显示，PAA2过表达导致的穗顶端退化与细胞死亡密切相关。此外，我们还检测了过氧化氢（H?O?）含量和过氧化氢酶（CAT）活性，发现PAA2过表达的植株中H?O?水平显著升高，这可能是钙离子异常积累导致细胞应激的体现。

在分子水平上，我们通过基因图谱定位和克隆方法确认了PAA2的基因位点。PAA2在水稻穗的多种分生组织中特异性表达，特别是在茎顶端、分生组织和发育中的枝条中。这一表达模式与PAA2在钙离子运输中的功能相吻合。此外，我们通过显微镜观察和荧光染色实验，发现PAA2在细胞膜和内质网中定位，并且其表达水平与钙离子浓度密切相关。这些结果支持PAA2在钙离子运输中的关键作用。

本研究揭示了PAA2在维持钙离子稳态中的重要作用，并提出了PAA2-OsUBC45模块可能在调控钙离子梯度中发挥关键作用。这一发现不仅深化了我们对钙离子在植物生长发育中作用的理解，也为水稻穗发育的调控机制提供了新的视角。未来研究可以进一步探索PAA2与其他钙离子转运蛋白之间的相互作用，以及其在不同植物组织中的表达模式和功能差异。这些研究将有助于更全面地理解钙离子在植物体内的运输和调控机制，并为提高水稻产量和抗逆性提供理论依据。