缓解抗体制剂中聚山梨酯降解导致的可见颗粒形成：从根本原因识别到策略性解决方案

《International Journal of Pharmaceutics》：Mitigating polysorbate degradation-induced visible particle formation in an antibody formulation: From root cause identification to strategic solution

本研究通过酶活性抑制实验和基于活性蛋白质组学（ABPP）的方法，鉴定了磷脂酶A2（PLA2）和磷脂酶B-like 2（PLBL2）作为PS20降解的潜在酶。利用CRISPR/Cas9技术敲除PLA2基因，发现PLA2是PS20降解的主要酶，其敲除显著减少游离脂肪酸（FFA）颗粒形成，并提升药物产品稳定性。同时验证了PLBL2并非主要贡献者。该研究为解决生物制药中表面活性剂降解问题提供了新策略。

　　在现代生物制药领域，聚山梨酯20（Polysorbate 20，简称PS20）作为一种非离子型表面活性剂，被广泛用于稳定治疗性蛋白，防止其聚集、降解和变性。然而，随着生产规模的扩大和蛋白浓度的提高，PS20的降解问题逐渐显现，成为行业关注的重点。PS20的降解不仅可能产生游离脂肪酸（FFAs），还可能影响药物的外观、稳定性，缩短其保质期，并增加免疫原性风险。因此，准确识别导致PS20降解的主要原因，成为确保药物质量的关键。

本研究以单克隆抗体mAb-1的生产过程为背景，重点探讨了PS20降解过程中可能涉及的宿主细胞蛋白（HCPs）。研究发现，PS20的降解主要由酶促水解引起，而这一过程中的关键酶包括磷脂酶A2（PLA2）和磷脂酶B样2（PLBL2，由Plbd2基因编码）。通过使用丝氨酸水解酶抑制剂和基于活性的蛋白质分析（ABPP）方法，研究团队成功鉴定了这两种酶对PS20降解的贡献。进一步地，通过对生产细胞株进行靶向基因敲除，发现PLA2是PS20降解的主要驱动因素，而PLBL2则不是主要贡献者。这一发现不仅为解决PS20降解问题提供了新的思路，也为生物制药行业在控制HCPs对药物成分影响方面提供了有力的支持。

本研究中，研究者首先通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）对mAb-1制剂中的可见颗粒进行了化学成分分析，确认其主要成分为脂肪酸。随后，采用反相高效液相色谱-荧光检测（RP-UPLC）和反相高效液相色谱-电离检测（RP-HPLC-CAD）等技术，进一步分析了PS20在制剂中的降解情况。结果表明，PS20在制剂中经历了显著的水解反应，生成了包括月桂酸、十四酸、棕榈酸、油酸和硬脂酸在内的多种脂肪酸。这些结果与文献中关于PS20降解产物的描述一致，验证了脂肪酸是导致制剂中出现颗粒的主要成分。

为了更深入地理解PS20降解的机制，研究团队利用ABPP技术对mAb-1制剂中的丝氨酸水解酶进行了富集分析。这一技术通过使用特定的探针（如ActivX Desthiobiotin-fluorophosphonate探针）标记具有活性的酶，并结合液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）分析，能够高效地识别出可能参与PS20降解的HCPs。研究结果显示，PLA2和PLBL2是主要的降解酶，其中PLA2的丰度远低于PLBL2，但其对PS20的降解作用更为显著。这一发现为后续的基因敲除实验提供了理论依据。

为了验证PLA2和PLBL2在PS20降解中的作用，研究团队采用CRISPR/Cas9技术构建了PLA2和PLBD2基因敲除的CHO细胞株。通过比较这些敲除细胞株与原始细胞株在PS20降解方面的差异，研究发现PLA2的缺失显著降低了PS20的降解速率，而PLBL2的缺失则对PS20的稳定性影响较小。这表明PLA2是导致PS20降解的主要原因，而PLBL2在这一过程中并非主要因素。此外，研究还发现，尽管PLA2的丰度较低（低于1 ppm），其对PS20的催化作用依然非常显著，能够在较低浓度下有效促进脂肪酸的生成，进而影响制剂的稳定性。

在实际生产过程中，研究团队对基因敲除细胞株进行了fed-batch培养实验，并评估了其对mAb-1生产性能的影响。结果显示，PLA2和PLBD2的敲除并未显著影响细胞的生长能力和抗体的产量。这表明，通过基因编辑手段去除PLA2，可以在不影响细胞生产性能的前提下，有效减少PS20的降解，从而提高制剂的稳定性。此外，研究还对制剂在不同温度条件下的稳定性进行了评估，发现PLA2敲除的细胞株在25°C和5°C的长期储存过程中均表现出更低的PS20降解率和更少的脂肪酸颗粒生成。

本研究还探讨了PS20降解的其他潜在因素，例如配方中的组分（如组氨酸）、制剂的pH值以及蛋白本身的理化性质。研究发现，组氨酸在配方中的存在可能对PS20的降解产生一定影响，但即便如此，PLA2的缺失仍能显著降低PS20的降解速率，使其接近配方缓冲液的控制水平。此外，研究团队还评估了不同蛋白对PS20降解的影响，发现某些蛋白的表面特性可能会影响PS20与蛋白质的相互作用，从而间接影响其稳定性。然而，PLA2的去除在多个实验条件下均表现出良好的效果，表明其在PS20降解中的核心作用。

研究团队进一步分析了PS20降解对制剂质量属性的影响，包括分子量分布、电荷异质性以及可见颗粒的形成。结果显示，尽管PLA2敲除的细胞株在长期储存过程中表现出PS20降解的显著减少，但其对制剂的整体质量影响较小，包括抗体的纯度、聚集率以及电荷分布等关键指标均未发生显著变化。这表明，通过去除PLA2，可以在不影响制剂质量的前提下，有效解决由HCPs引起的PS20降解问题。

本研究提出了一种综合性的解决方案，涵盖从颗粒的识别、机制研究到有效控制的全过程。通过结合生化分析和基因编辑技术，研究团队不仅成功鉴定了PLA2为PS20降解的主要原因，还验证了基因敲除策略在实际生产中的可行性。这一方法为生物制药行业提供了一种新的思路，即通过控制特定的HCPs来提高制剂的稳定性。此外，研究还强调了基因编辑技术在生物制药领域的应用潜力，特别是在解决由HCPs引起的药物质量问题方面。未来，类似的方法可能被应用于其他表面活性剂（如PS80）的稳定性研究，为生物制药的持续改进提供理论支持和技术手段。

综上所述，本研究通过系统性的实验设计和分析方法，揭示了PLA2在PS20降解中的关键作用，并验证了基因敲除策略在减少PS20降解方面的有效性。这一成果不仅有助于提高生物制药产品的稳定性，还为行业在控制HCPs对药物成分影响方面提供了新的思路和方法。同时，研究还强调了生化分析和基因编辑技术在解决此类问题中的重要性，为未来的研究和应用奠定了基础。