基于色酮吲哚-吡唑钴纳米粒子的电化学免疫传感器用于胰岛素抗体检测

《ChemNanoMat》：Chromone Indole-Pyrazole Cobalt Nanoparticle-Based Electrochemical Immunosensor for Insulin Antibody Detection

绿色合成的CIP-CoNPs修饰电极构建了高灵敏度的电化学免疫传感器，检测胰岛素抗体线性范围0.001-50 ng/mL，检测限0.34 ng/mL，相对标准偏差1.19-2.34%，适用于1型糖尿病早期诊断。

　　本研究介绍了一种用于检测胰岛素抗体的高灵敏度电化学免疫传感器，该抗体是遗传易感人群中早期1型糖尿病（T1D）的预测生物标志物。这种传感器的构建基于一种新型的绿色合成方法，利用柠檬皮提取物制备出一种含铬酮-吲哚-吡唑配体的钴纳米颗粒（CIP-CoNPs），并将其固定在铂电极上。随后，通过固定胰岛素抗原和使用牛血清白蛋白（BSA）进行表面封闭，构建出一种具有优异性能的免疫传感器。研究结果表明，该传感器在优化条件下能够检测胰岛素抗体，其线性范围为0.001–50 ng mL?1，检测限低至0.34 ng mL?1，灵敏度高达5.60 μA ng mL?1。此外，该传感器在合成的人类血清中表现出良好的重复性和准确性，回收率在98.7–101.3%之间，相对标准偏差（RSD）为1.19–2.34%，显示出其在临床应用中的巨大潜力。

1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，主要特征是胰岛β细胞的破坏导致胰岛素绝对缺乏。由于胰岛素抗体与该疾病的密切关联，开发一种高灵敏度、高选择性、高效且经济的检测方法对于早期诊断和疾病管理至关重要。传统方法如放射免疫分析（RIA）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和表面等离子体共振（SPR）虽然具备高特异性和灵敏度，但往往存在成本高、操作繁琐、样品处理复杂以及辐射危害等问题。相比之下，电化学传感器因其高灵敏度、快速分析时间、低样品体积需求、自动化潜力和经济性，成为检测生物标志物的理想平台。特别是电化学免疫传感器，能够将生物识别事件转化为可量化的电信号，因此在抗体检测领域展现出广阔的应用前景。

电化学传感技术主要包括伏安法、电位法和阻抗法等。其中，伏安法因其操作简便和高选择性，被广泛用于生物分子的检测。本研究中的传感器采用平方波伏安法（SWV）进行分析，同时利用循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）对电极表面的修饰进行表征。通过这些技术，研究者能够深入理解纳米复合材料的结构如何影响电化学性能，以及传感器在构建过程中各个步骤对信号响应的具体贡献。

钴纳米颗粒（CoNPs）因其多功能特性而受到广泛关注，包括抗菌活性、电化学传感能力和光催化潜力。与贵金属相比，CoNPs不仅成本更低，还能提供类似的磁性、催化性和电学性能，这主要得益于其较大的表面积。然而，传统的物理和化学合成方法通常需要有毒试剂，这可能对环境造成负面影响。为了解决这一问题，研究者采用了一种基于植物材料的绿色合成方法，其中柠檬皮提取物被用作还原剂和稳定剂。柠檬皮作为柑橘类水果的一部分，广泛种植且商业价值高，其废弃部分则提供了丰富的生物活性化合物，成为制备纳米材料的理想原料。研究者发现，柠檬皮提取物中的多种生物分子，如黄酮类、酚类和含氮化合物，不仅促进了钴离子的还原，还通过非共价相互作用稳定了纳米颗粒，使其在电化学环境中表现出优异的性能。

为了进一步提升传感器的性能，研究者引入了一种新的配体——铬酮-吲哚-吡唑（CIP）结构。该配体通过其电子丰富的π体系和多个供体原子（如氮和氧）与纳米颗粒表面形成稳定的配位键，从而提高了纳米颗粒的稳定性和电荷传递效率。CIP的引入不仅增强了电极与目标生物分子之间的电子传递，还通过π-π堆积和氢键作用，促进了抗体与抗原的有效结合，提升了信号的传递效率。通过扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线光谱（EDS）分析，研究者确认了CIP-CoNPs的球形结构和元素组成，其中碳、氧和钴为主要成分，硫则来源于CIP配体的引入。

在传感器的构建过程中，电极的修饰步骤至关重要。首先，铂电极经过手动和电化学清洗，以确保其表面清洁。随后，CIP-CoNPs被滴涂在电极表面，并在37℃下干燥。接下来，通过添加还原性谷胱甘肽（GSH）作为桥接分子，将胰岛素抗原固定在纳米颗粒表面，进一步优化了抗原的结合效率。最后，使用BSA对电极表面进行封闭，以减少非特异性结合。通过CV和EIS的测试，研究者发现，与原始铂电极相比，CIP-CoNPs修饰后的电极表现出显著降低的电荷转移电阻（Rct），表明其具有更高的电导率和更快的电子传递速率。随着抗原和BSA的逐步添加，Rct值逐渐增加，但始终处于可控范围内，证明了各层修饰的合理性和传感器在复杂环境下的稳定性。

为了确保传感器在实际应用中的性能，研究者对实验条件进行了系统优化。包括pH值、扫描速率、抗原固定体积、固定时间和温度等因素均被测试，以找到最佳的参数组合。结果显示，pH值为6.4时，电极的响应最强，因此被选定为最佳检测条件。扫描速率的优化表明，100 mV s?1是最佳选择，因为在此速率下，电流响应与扫描速率的平方根呈线性关系，表明电荷转移过程主要受扩散控制。抗原固定体积和时间的测试也显示，4 μL的固定体积和120分钟的固定时间能够实现最佳的抗原结合效果，而37℃的温度则进一步提高了结合效率。这些优化结果为传感器的实际应用提供了重要的理论依据。

在分析性能方面，传感器通过SWV技术对胰岛素抗体进行了检测，结果显示其具有极高的灵敏度和选择性。检测的线性范围为0.001–50 ng mL?1，R2值达到0.994，表明传感器的响应与抗体浓度之间存在良好的线性关系。与以往报道的电化学传感器相比，该传感器的检测限显著降低，达到0.34 ng mL?1，这使得其能够检测到更低浓度的胰岛素抗体。此外，通过引入常见的干扰物质（如人血清白蛋白、抗坏血酸、葡萄糖、尿酸和多巴胺），研究者进一步验证了传感器的高选择性。实验结果表明，这些干扰物质对电流响应的影响远小于胰岛素抗体，从而证明了传感器在复杂生物样品中的可靠性。

为了评估传感器在实际样品中的适用性，研究者在合成的人类血清中进行了回收实验。实验中，胰岛素抗体被添加到模拟血清中，并通过SWV进行检测。结果表明，传感器在不同添加浓度下均能实现高回收率（98.7–101.3%）和低RSD（1.19–2.34%），这说明其在复杂生物基质中具有良好的稳定性和准确性。回收实验的结果进一步支持了该传感器在临床诊断中的可行性，尤其是在早期T1D的筛查和监测方面。

此外，研究者还对传感器的重复性和可重复性进行了测试。通过在相同条件下重复构建六次传感器并检测5 ng mL?1的胰岛素抗体，结果显示其具有优异的重复性，RSD值为1.47%。而在同一传感器上进行50次连续检测，电流响应在前25次保持稳定，之后逐渐下降，这可能与电极表面的轻微降解或污染有关。尽管如此，这种短期的稳定性仍然表明该传感器具备良好的可重复性，适合在实际环境中进行多次测量。

总体而言，本研究成功开发了一种基于CIP-CoNPs的高灵敏度电化学免疫传感器，能够高效检测胰岛素抗体。该传感器不仅在性能上优于传统方法，还具有良好的选择性、稳定性和重复性，使其在临床诊断中展现出广阔的应用前景。其使用绿色合成方法，不仅降低了环境影响，还提升了经济性和可持续性，为未来纳米材料在生物传感领域的应用提供了新的思路。该研究为早期1型糖尿病的检测提供了一种便捷、快速、低成本的解决方案，有助于推动精准医学和个性化医疗的发展。