使用经过金偶联的抗受体结合域抗体修饰的ZnO纳米棒对唾液中的SARS-CoV-2进行电化学检测

《ChemNanoMat》：Electrochemical Detection of SARS-CoV-2 in Saliva Using ZnO Nanorods Functionalized with Gold-Conjugated Antireceptor-Binding Domain Antibodies

基于ZnONRs和AuNPP-4B1D3的电化学免疫传感器快速检测SARS-CoV-2 RBD蛋白，实现非侵入性唾液样本中病毒变体的特异性识别（Wuhan-Omicron），检测限1.7 μg/mL。

　　在2020年全球爆发新冠疫情后，公共卫生领域对快速、便捷且成本效益高的诊断技术需求日益迫切。传统检测方法虽然有效，但通常需要昂贵的设备和较长的处理时间，这限制了其在基层医疗场景中的应用。本文介绍了一种基于氟掺杂锡氧化物（FTO）电极修饰锌氧化物纳米棒（ZnONRs）的电化学免疫传感器，用于检测新冠病毒（SARS-CoV-2）唾液样本中的受体结合域（RBD）。ZnONRs因其较大的表面积、低成本的生产特性以及高效的电子传输性能，成为理想的传感平台。为了提升选择性和灵敏度，ZnONRs被功能化，结合了金纳米颗粒（AuNPs）修饰的单克隆抗体（mAbs）。对四种mAbs（2B9F9、3E5G8、4B1D3和4H4A2）的评估结果显示，尽管所有mAbs在酶联免疫吸附试验（ELISA）中均能识别RBD，但只有4B1D3在电化学方法中产生可检测信号，其检测限为1.7 μg/mL，并且能够识别原始武汉株和奥密克戎变种。该免疫传感器在实际人类唾液样本中的测试表现良好，进一步验证了其作为非侵入性、快速且可扩展的点对点（POC）病毒诊断平台的潜力。

电化学生物传感器是一种能够将生物分子相互作用转化为可测量电信号的分析设备。它们通过使用生物分子作为识别元素，展现出高度的敏感性和选择性，因此成为开发新型POC诊断工具的有力候选。然而，这类传感器的性能在很大程度上取决于生物识别分子在电极表面的有效固定，同时不能损害其生物活性，并且需要合适的界面来检测目标物质。金属纳米结构因其优异的导电性和催化特性，常用于生物传感器设计，这些特性有助于促进生物分子与电极之间的电子转移。此外，过渡金属氧化物，如锌氧化物（ZnO），因其低成本、化学稳定性和良好的生物相容性，成为生物传感应用中特别有吸引力的材料。

在ZnO基纳米结构中，一维（1D）结构，如纳米线、纳米片和纳米管，因其高表面积与体积比、高效的电荷传输和电催化活性而备受关注。这些特性有助于实现传感器的小型化，并促进有效信号转换。其中，ZnONRs因其可与mAbs结合的特性，成为构建免疫传感器的多功能平台。尽管免疫传感器利用抗原-抗体对之间的强亲和力和特异性，但如何有效固定抗体仍然是一个关键挑战。一种有效的方法是将mAbs与AuNPs结合，这可以增强固定效率、取向控制以及电子转移。由此产生的AuNP-抗体生物偶联物结合了mAbs的选择性与金纳米颗粒的光学和电子特性，使得构建高灵敏度和高重现性的检测平台成为可能。

近年来，新冠疫情的爆发凸显了快速、可及且成本效益高的诊断技术的重要性。尽管逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）被认为是SARS-CoV-2检测的黄金标准，但它需要专门的实验室和受过专业训练的人员，这限制了其在大规模应用中的可行性。免疫层析横向流动试验（LFAs）也已被广泛应用，但其灵敏度较低，且检测通量有限。因此，电化学生物传感器因其低成本、可扩展性和高效性，逐渐受到关注。它们能够以较短的响应时间检测低浓度的分析物，这使其成为在分散化场景中进行快速诊断的理想工具。这种技术的灵活性和高效性使其在POC应用中具有显著优势。

在本研究中，我们开发了基于FTO电极修饰ZnONRs，并结合了AuNPs修饰的四种mAbs的简单、快速且经济的电化学免疫传感器。在ELISA中，所有克隆均能识别武汉株的RBD，但只有4B1D3在电化学方法中产生可检测信号，其检测限为1.7 μg/mL，并且能够识别武汉株和奥密克戎变种。该传感器在实际唾液样本中的测试表现良好，进一步验证了其作为非侵入性、快速且可扩展的POC病毒诊断平台的潜力。

为了进一步验证免疫传感器的性能，我们通过ELISA和电化学方法对四种mAbs进行了评估。结果显示，尽管所有mAbs在ELISA中均能识别RBD，但只有4B1D3在电化学方法中表现出显著的响应。这表明，在抗体选择和表面取向方面存在关键差异。通过荧光显微镜观察，只有4B1D3表现出显著的荧光信号，而其他mAbs则几乎没有信号，这说明其无法有效识别抗原，可能由于空间位阻或不利的取向。此外，4B1D3表现出对武汉株和奥密克戎变种的广泛识别能力，而其他mAbs则缺乏这种广谱特异性，如之前所述。

在实际应用中，唾液样本的检测具有重要意义。与传统的鼻咽拭子相比，唾液采样更加无创，且易于获取。然而，唾液样本中蛋白标志物的浓度较低，这直接影响了生物传感器的检测限。因此，生物传感器在唾液中的检测限通常高于血清样本。此外，唾液样本的处理和储存仍面临一定挑战，特别是在确保样本稳定性和防止交叉反应方面。因此，进一步研究是必要的，以提高针对唾液样本的生物传感器的灵敏度和性能。

为了验证传感器在实际样本中的性能，我们对13份人类唾液样本进行了测试，其中13份呈阳性，8份呈阴性。结果显示，该传感器能够有效区分SARS-CoV-2阳性与阴性样本，并且在不同浓度下表现出良好的灵敏度和动态范围。在测试过程中，我们观察到不同样本之间的信号强度存在差异，这可能反映了不同个体在采样时的病毒载量。同时，该传感器在检测奥密克戎变种时表现出更强的响应，这进一步验证了其在复杂生物环境中的适用性。

在电化学传感器的设计中，纳米材料的使用具有重要意义。ZnONRs和AuNPs的结合不仅提升了生物分子的固定效率，还增强了传感器的稳定性和灵敏度。此外，该传感器的构建过程涉及多个步骤，包括电极的修饰、生物分子的固定以及目标抗原的识别。这些步骤的系统性验证确保了传感器的可靠性和一致性。

该研究的成果表明，基于ZnONRs和AuNPs的免疫传感器在实际应用中具有显著优势。其检测限为1.7 μg/mL，响应时间约为7分钟，这使其成为一种快速、可及且适用于POC场景的检测方法。尽管该传感器的检测限高于一些基于血清的平台，但其在唾液样本中的性能仍然优于其他类型的生物传感器。此外，该传感器的模块化设计使其具备进一步扩展的可能性，可用于检测其他病毒目标或生物标志物，拓展其在传染病诊断中的应用。

在实验过程中，我们采用多种技术对传感器的性能进行了评估。包括光谱分析（UV-Vis和荧光）、胶体分析（ZP和DLS）、显微镜分析（SEM和共聚焦显微镜）以及电化学分析（CV和EIS）。这些技术的结合不仅确保了传感器的可靠性，还为优化其性能提供了理论依据。通过这些分析，我们确认了ZnONRs在电极表面的修饰效果，以及AuNPs-抗体偶联物在传感器中的固定效率。

该研究还强调了抗体选择在传感器性能中的关键作用。4B1D3 mAb由于其特定的电荷特性和结构，表现出优于其他mAbs的性能。在电化学检测中，4B1D3能够与RBD发生有效的相互作用，从而实现较高的检测灵敏度和选择性。此外，通过不同浓度的唾液样本测试，我们验证了该传感器在实际应用中的可行性，并确认了其在不同病毒变种检测中的适应性。

总体而言，该研究展示了基于ZnONRs和AuNPs的免疫传感器在SARS-CoV-2检测中的潜力。其快速响应时间、低成本和非侵入性采样方式，使其成为POC场景中的理想选择。此外，该传感器的模块化设计为其在其他病毒检测中的应用提供了可能。随着病毒变异的不断出现，具备高灵敏度和广谱识别能力的诊断工具显得尤为重要。本研究的成果为未来开发更高效的生物传感器提供了重要的理论和实践基础。