多组学方法用于探索不同苹果品种中与风味相关的关键代谢途径

《Journal of Agriculture and Food Research》：Multi-omics approach for exploring key flavor-related metabolic pathways in different apple cultivars

苹果风味形成代谢与转录组学研究。基于转录组学和代谢组学的多组学分析，揭示了九条关键代谢通路（包括三羧酸循环、糖代谢和酯类合成途径）在苹果风味形成中的作用，阐明了风味物质（如酯类、有机酸）的代谢网络及调控基因（如glyA、AGXT）的表达规律，为苹果风味品种选育提供理论依据。

　　本研究通过一种多组学方法，结合转录组学和代谢组学，揭示了不同苹果品种在主要风味形成路径中的代谢变化。通过对代谢通路的富集分析，研究人员发现与苹果风味生物合成相关的九条显著代谢通路，包括三羧酸循环（TCA cycle）、淀粉和蔗糖代谢以及丁酸代谢等。基于这些通路，研究进一步阐明了三种核心代谢网络，分别负责水果风味、异味以及糖分的生物合成。研究结果表明，苹果中较高水平的苹果酸、柠檬酸和琥珀酸与增强的三羧酸循环流量和能量代谢有关，这可能促进酯类物质的生物合成，并有助于水果风味的形成。转录组分析还揭示了如glyA、AGXT和ilvE等关键基因与水果酯类物质合成的关联，而xylA和malZ则与异味醛类和糖代谢有关。通过整合代谢物和基因表达图谱，研究人员发现了风味前体与产物之间的关系，并深入探讨了代谢通路之间的相互作用对风味形成的影响。本文提出的研究策略和流程展示了其在解析苹果风味相关复杂代谢网络方面的有效性，并为开发具有更优感官品质的苹果品种奠定了基础。

苹果作为一种重要的园艺水果，其生产量在2023/2024年达到84.32百万公吨。苹果因其优良的口感、香气和高营养价值而被全球广泛消费。苹果不仅富含膳食纤维、维生素C、矿物质和抗氧化物，如黄酮类化合物和多酚，还因其多样的食用形式而受到欢迎，包括新鲜水果、果汁、果酱、干果片和果泥。苹果的风味是影响消费者接受度和偏好的关键因素之一。苹果的风味特征由代谢物与基因的相互作用形成，这使得在果实成熟过程中，苹果呈现出多种多样的味道和香气。在水果和蔬菜中，风味的形成通常依赖于非挥发性化合物（如糖类和有机酸）与挥发性化合物（如酯类、醛类和醇类）的共同作用。这些化合物之间的相互作用，构成了苹果风味的复杂平衡，包括甜味、酸味和苦味，以及多样化的香气。

此前的研究表明，风味在决定苹果整体喜好方面起着至关重要的作用，其影响可能超过颜色和质地等其他因素。该研究还确认了苹果风味是由非挥发性和挥发性化合物之间的和谐作用形成的。例如，水果酯类物质如2-甲基丁基乙酸酯（水果味）和丁基丁酸酯（水果味，菠萝味）与总糖（甜味）和酸类（酸味）相关，这些因素与消费者偏好的苹果风味紧密相连。相比之下，如呋喃甲醛（杏仁味）和呋喃甲醇（焦味）以及(E)-2-壬烯醛（黄瓜味）等化合物则与较低的愉悦度相关。然而，该研究并未完全确定这些关键风味化合物的生物合成来源。

尽管已有多个研究探讨了苹果风味的个别前体，但其风味形成背后的遗传基础，特别是与代谢物变化相关的部分，仍不够明确。这主要是由于缺乏整合代谢物图谱与基因表达数据的全面分析。此外，我们对苹果品种之间风味生物合成的分子调控机制的理解仍然有限。特别是在风味前体和产物的代谢物图谱与基因表达模式之间的相互作用，尚未完全明确。为了更全面地理解苹果的风味形成，结合基因组学、转录组学、蛋白质组学和/或代谢组学的多组学方法是必不可少的。这种方法能够从不同的生物层面探讨风味生物合成的机制。近年来，多组学技术的进步加速了风味相关通路在水果育种项目中的研究。

然而，在苹果中，利用整合多组学方法的研究仍然非常有限。迄今为止，大多数代谢组学研究主要集中在苹果果皮和果肉中M. domestica和M. baccata水果的植物化学图谱分析，以及不同生产系统下苹果代谢物的差异，以及苹果摄入后潜在尿液生物标志物的识别。转录组学研究则主要探讨了苹果果皮红色变化相关的基因表达，苹果病害类型感染的反应，以及乙烯调控的香气生产。少数研究结合了代谢组学和转录组学分析，但这些研究大多关注于成熟过程中挥发性化合物（如最终风味产物）的变化，而对上游风味前体关注较少。调控成熟苹果风味形成的分子机制仍待进一步探索。理解在成熟阶段的化学成分及其相关的遗传因素至关重要，因为它们可能在塑造整体苹果风味和影响消费者偏好方面发挥重要作用。

为了填补这一知识空白，本研究旨在识别与品种依赖性风味特征相关的关键代谢物和转录组变化，从而揭示成熟苹果风味多样性的生物学基础。在我们之前的研究基础上，本研究进一步探讨了主要风味生物合成通路及驱动风味形成的分子机制。为实现这一目标，采用了一种整合代谢组学和转录组学的多组学方法，以研究风味相关代谢物、基因表达模式及其在三种苹果品种中的关系。最终，本研究试图提供支持苹果风味质量提升的分子见解。

在本研究中，研究人员收集了四个苹果品种（“Gamhong”、“Yangwang”、“Hongro”和“Fuji”）的成熟果实，这些品种是韩国广泛种植的主要苹果品种之一。根据之前的感官评估，“Gamhong”和“Fuji”因其高挥发性酯类物质（如己基乙酸酯和2-甲基丁基乙酸酯）形成的愉悦的水果和苹果香气，以及良好的糖酸比例（总糖、酒石酸和苹果酸）而受到消费者喜爱。相比之下，“Yangwang”和“Hongro”则表现出较高的醛类和醇类（如(E)-2-壬烯醛）含量，这些化合物与绿色或黄瓜味的异味相关，并且具有较低的愉悦度评分。基本的生理参数，如总可溶性固形物（°Brix）、可滴定酸度和果肉颜色，也曾在我们之前的研究中报告过，并汇总在补充表S1中。其中，“Gamhong”表现出最高的总可溶性固形物（16.18 °Brix）和中等酸度（0.23%），从而获得了较高的TSS/TA比率（70.29）。而“Hongro”则表现出最低的总可溶性固形物（11.98 °Brix）和酸度（0.21%）。“Yangwang”具有相对较低的总可溶性固形物（13.78 °Brix），但较高的酸度（0.23%）。而“Fuji”则在这些参数上表现出中等水平（14.70 °Brix，0.25%）。对于每个品种，从三棵不同的树上随机选取六个果实（每棵树两个果实；n = 6）。所有树木均处于经济结果年龄（>5年）且大小相似（3-4米高）。果实根据重量、形状、成熟度和无病害的均匀性进行选择。收获后，样品被立即送往位于韩国庆尚北道的庆州国立大学进行转录组分析。同时，样品被冷冻干燥48小时，使用冷冻干燥机（FDTA-4504，Operon Co. Ltd.，韩国）进行代谢组学分析。冷冻干燥后，样品被使用研钵和研杵与液氮进行均质化处理。所有样品在代谢组学和转录组学分析前被保存在-80°C下约三个月。

为了研究成熟苹果品种依赖性风味形成的分子基础，建立了一个全面的实验框架，包括代谢组学和转录组学分析。果实果肉组织被制备用于多组学分析，包括代谢物和基因表达图谱。代谢组学分析包括非靶向和靶向两种方法。非靶向分析使用亲水相互作用色谱（HILIC）和反相色谱（RP）进行分离，这两种色谱方法分别与四极杆时间飞行质谱仪（Q-TOF/MS）联用。靶向分析则使用三重四极杆（QqQ）质谱仪对关键通路相关代谢物进行定量。转录组分析则通过RNA测序（RNA-seq）进行，使用高纯度的苹果组织总RNA。差异表达基因（DEGs）被识别，并进一步进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，以确定其生物学意义。最后，代谢组学和转录组学数据集被整合并使用多元统计方法进行分析，以揭示与苹果风味形成相关的关键代谢和调控网络。各实验的详细信息在第2.3至2.9节中提供。

在本研究中，研究人员采用了非靶向代谢组学方法，以识别不同苹果品种的代谢物图谱。为了最大化代谢物覆盖范围，使用了RP-LC和HILIC两种色谱方法。RP-LC系统配备C30色谱柱，以提高非极性和半极性代谢物（如酯类、脂肪酸和有机酸）的分辨率，这些代谢物在苹果中具有重要的区分作用。此外，HILIC色谱柱被用于增强高极性代谢物（如糖类、糖磷酸盐和有机酸）的保留和分离。这种互补的色谱方法确保了广泛的代谢组覆盖，并且更可靠地检测了苹果风味相关代谢物。每种生物样品均在四种不同的分析条件下进行分析。从不同苹果品种中获得了33,539个特征（RP正离子：9,546；RP负离子：2,691；HILIC正离子：9,332；HILIC负离子：11,970）。其中，17,071个特征（RP正离子：4,031；RP负离子：1,980；HILIC正离子：4,009；HILIC负离子：7,051）在统计学上具有显著性（p < 0.05）。

为了分析苹果品种之间的代谢差异，研究人员进行了主成分分析（PCA）。PCA得分图显示，苹果代谢物的变化可以分为四个主要聚类，由品种区分。虽然在RP正离子模式下，部分样品未能被清晰区分，但总体上，PCA图使用了总变异的前两个主成分（PC1和PC2）进行构建。在HILIC模式下，负离子和正离子PCA图分别解释了31%和26%的变异。对于RP模式，负离子和正离子PCA图分别解释了43%和25%的变异。QC样品被聚类在一起，表明PCA得分图具有良好的重复性和分析可靠性。

为了评估组间的可比性并验证导致不同苹果品种聚类的代谢物，研究人员进行了监督的PLS-DA分析，使用VIP值>1作为筛选标准。PLS-DA得分图显示，四种苹果品种的代谢物可以被清晰地分为四个聚类。观察到的PLS-DA模型具有良好的系数（p < 0.05），且在正向预测能力方面表现出色（R2Y = 0.990，Q2 = 0.961），并解释了66.8%的总变异。在置换测试（n = 200）中，R2和Q2的截距分别为0.0和-0.414，这证实了模型没有过拟合。这些结果表明，通过非靶向代谢组学结合RP和HILIC色谱指纹，可以有效地揭示品种依赖的代谢组变化，为苹果风味多样性的生化基础提供有价值的见解。

研究还探索了与关键风味化合物相关的代谢通路。在我们之前的研究中，我们确定了苹果中的关键风味化合物，包括芳香化合物（如丁基乙酸酯、丁基丁酸酯和2-甲基丁基乙酸酯）和味道化合物（如苹果酸、柠檬酸、酒石酸、果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇）。这些代谢物的信息在表S4中提供。基于这些化合物，研究人员搜索了KEGG数据库和相关文献，以识别风味相关的代谢通路。从非靶向和靶向分析中，共发现了65种参与风味相关通路的代谢物（4种酰基辅酶A，4种醇类，2种醛类，7种氨基酸，3种酯类，2种内酯，17种有机酸，12种糖类，2种糖醇，7种糖磷酸盐，以及5种其他代谢物）（表S5–7）。其中，25种代谢物在品种间表现出统计学显著性（p < 0.05）且VIP值>1（表S8）。不同品种的代谢组成和差异在表S4和表S6、S7中进行了展示。使用二维数据可视化和颜色表示生成的热图（图2A）显示，每个品种的六个重复样品被聚类在一起，表明其独特的代谢物组成。

在风味相关通路的富集分析中，识别出九条代谢通路，包括1）柠檬酸（TCA）循环，2）光合生物中的碳固定，3）丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，4）丁酸代谢，5）淀粉和蔗糖代谢，6）抗坏血酸和醛糖酸代谢，7）糖酵解/糖异生，8）戊糖和葡糖醛酸互变，以及9）果糖和甘露糖代谢。这些通路在苹果风味生物合成中发挥着关键作用，包括糖类和有机酸代谢、香气形成以及能量调节，它们直接影响果实风味的感知。通过这些通路的富集分析，研究人员能够确定哪些代谢通路在苹果风味形成中具有重要影响。

在风味形成路径的串联反应中，研究人员识别出32个差异表达基因（DEGs），其中包括与2-甲基丁基乙酸酯合成相关的基因，如甘氨酸羟甲基转移酶（glyA）、丙氨酸-草酸盐转氨酶（AGXT）和支链氨基酸氨基转移酶（ilvE）（图4）。这些基因在“Fuji”中显著上调，与该品种中2-甲基丁基乙酸酯的高浓度相一致。此外，基因pk和ppdk与将丙酮酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）有关，而基因pckA和PPC则参与将PEP转化为草酰乙酸，草酰乙酸随后被转化为苹果酸。在“Gamhong”中，MDH的上调与该品种中苹果酸的增加相一致。糖酵解后，氨基酸代谢导致2-甲基丁基乙酸酯的产生。DEGs（glyA、AGXT和ilvE）在“Fuji”中显著上调，这与该品种中2-甲基丁基乙酸酯的高浓度相符。

在形成异味的通路串联反应中，研究人员识别出14个DEGs，其中包括与呋喃甲醛和呋喃甲醇合成相关的基因，如木糖异构酶（xylA）、α-葡萄糖苷酶（malZ）、L-赤藓糖醇2-脱氢酶（SORD）、肌醇氧化酶（MIOX）、肌醇-磷酸磷酸酶（IMPL2）、GDP-L-半乳糖磷酸酶（VTC2_5）和GDP-D-甘露糖3',5'-异构酶（GME）（图5）。尽管没有直接调控呋喃甲醛和呋喃甲醇形成的DEGs被识别，但一些检测到的DEGs可以解释这些通路中上游化合物的代谢机制。例如，基因SORD在“Fuji”中高度上调，支持该品种中山梨醇的积累。同样，基因IMPL2、VTC2_5和GME的表达趋势也可以解释为何“Fuji”中半乳糖的积累较高。在“Fuji”中，另一个基因xylA也被上调，这可能与该品种中木糖的相对高水平有关。

在苹果糖生物合成通路中，研究人员识别出9个DEGs，其中包括与糖类合成相关的基因，如核糖-5-磷酸异构酶A（rpiA）、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基（rbcS）、三碳磷酸异构酶（TIM）、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（ALDO）、赤藓糖醇-磷酸磷酸酶、木糖异构酶（xylA）、α-葡萄糖苷酶（malZ）和二磷酸依赖的磷酸果糖激酶（pfp）（图6）。基因malZ在“Hongro”中显著上调，支持该品种中葡萄糖的积累。基因xylA在“Fuji”中上调，支持该品种中山梨醇的增加。

本研究通过多组学方法，结合转录组学和代谢组学，揭示了苹果风味相关化合物在关键生物合成通路和网络中的形成。通过这种策略，研究人员阐明了风味前体与产物及其相关基因之间的关系，以及代谢物在这些网络中的流动。研究结果表明，风味相关分子的生物合成是代谢物和基因之间复杂相互作用的结果，其影响可能源于两者的协同效应。尽管本研究中的调控关系是通过转录-代谢物相关性推断得出的，但未来的研究需要包括基因功能验证和酶活性测定，以确认所识别基因在苹果风味生物合成中的具体作用。此外，虽然本研究关注于消费者偏好的成熟苹果风味特征，但未来还需进一步研究不同生产地区环境变量对苹果风味的影响，以更好地理解基因型-环境相互作用如何影响苹果风味。观察到的品种间代谢变化为未来开发具有理想风味特性的苹果品种提供了潜在资源。本文提出的分析策略将成为理解水果风味生物合成通路中代谢流动及其相关分子机制的重要基石。