酰基辅酶A脱氢酶Tfu_1647的底物结合口袋的半理性设计，以提高其对6碳底物的催化活性

《Journal of Biotechnology》：Semi-rational design of the substrate-binding pocket of acyl-CoA dehydrogenase Tfu_1647 to improve catalytic activity for 6-carbon substrates

本研究解析了Tfu_1647酶的晶体结构，通过半理性设计筛选出Thr370Gln突变体，使其对6C-CoA的亲和力提升25.7%（Kd=1.48×10?? M?1）和催化效率提高2.3倍（kcat=0.98 min?1），结构分析显示底物结合口袋扩大并优化了静电环境，分子动力学和自由能计算证实该突变体对中链底物特异性增强。

　　在当前全球能源结构面临转型的背景下，寻求可再生、高能量密度的碳氢化合物及其衍生物的生产方式已成为科研领域的热点。这类化合物在多个工业领域中具有广泛应用，如化工、食品、纺织、农药、医药和液晶材料等。在这些化合物中，线性中链二羧酸（MDCAs）因其广泛的用途而受到特别关注。MDCAs的合成过程涉及对碳骨架的修饰，其中α, β-脱氢化反应是关键步骤之一。该反应通常由一系列酰基辅酶A脱氢酶（ACADs）催化完成，而ACADs的结构和功能特性决定了其对不同长度和分支结构底物的识别能力。

Tfu_1647作为来自Thermobifida fusca B6菌株的中链酰基辅酶A脱氢酶（MCAD）成员，能够可逆地催化4C至10C酰基辅酶A转化为相应的烯酰基辅酶A中间体。这一特性使其在脂肪酸和二羧酸代谢中具有重要地位。在我们的研究中，Tfu_1647与Tfu_0875、Tfu_2399、Tfu_0067、Tfu_2576和Tfu_2577共同构成了逆向己二酸降解途径（RADP），该途径能够利用乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、琥珀酰辅酶A或戊酰辅酶A作为底物，合成己二酸、戊二酸和戊烯酸等重要产物。值得注意的是，己二酸的产量最高，这表明Tfu_1647对于6C-辅酶A具有较高的偏好性，尽管其底物范围较为广泛。然而，代谢通量分析显示，Tfu_1647是RADP中己二酸合成的限速步骤，因此，提升其对6C-辅酶A的催化活性和特异性，对于提高己二酸产量至关重要。

为了实现这一目标，我们对Tfu_1647的结构和功能进行了系统研究。尽管Tfu_1647在催化6C-辅酶A的α, β-脱氢化反应中表现出色，但其结构信息的缺失严重限制了对其催化机制的深入理解。因此，我们通过高分辨率晶体结构的解析，获得了Tfu_1647的三维构象信息，为后续的理性设计提供了重要基础。基于该结构，我们采用半理性设计策略，对Tfu_1647的底物结合口袋进行了改造，旨在增强其对6C-辅酶A的结合亲和力和催化效率。在众多改造后的变体中，Tfu_1647 Thr370Gln（T370Q）表现出最佳的性能，其对6C-辅酶A的解离常数（Kd）显著降低，达到1.48 × 10?? M?1，同时催化速率（kcat）也提升了2.3倍，相较于野生型Tfu_1647分别提高了25.7%和2.3倍。这些结果表明，通过扩大底物结合口袋并适度调整局部静电势，可以在保持辅酶FAD结合能力的同时，显著提高Tfu_1647对6C-辅酶A的催化效率。

进一步的分子动力学模拟和自由能分析显示，Thr370Gln突变不仅优化了Tfu_1647的底物特异性，还使其对中链（C6）底物表现出明显偏好，而对较短或较长的酰基辅酶A则表现出较低的亲和力。这一发现为Tfu_1647在己二酸生物合成中的应用提供了理论依据，并为其他MCADs的理性设计提供了可借鉴的策略。此外，Tfu_1647的结构信息也为理解ACADs的催化机制提供了新的视角，尤其是在如何通过结构改造来调控底物选择性和催化效率方面。

ACADs是一类具有高度保守结构的酶，其活性位点通常包含辅酶FAD和保守的谷氨酸残基。这些酶的三级结构主要由三个核心域组成：中央的β-折叠结构域、N端的α-螺旋结构域和C端的α-螺旋结构域。这种结构特征使得ACADs能够适应多种底物，但同时也导致了其对底物长度和分支结构的识别能力有限。例如，一些ACADs仅能特异性地识别短链或长链底物，而另一些则对中链底物表现出较高的偏好性。这种多样性反映了ACADs在不同生物体中的适应性进化，同时也为工程改造提供了潜在的方向。

在本研究中，我们不仅解析了Tfu_1647的晶体结构，还通过实验验证了其催化性能。由于烯酰基辅酶A底物难以获得且稳定性较差，我们选择研究Tfu_1647的脱氢化反应，以评估其催化活性。根据微观可逆性原理，氧化和还原反应在反应路径中具有对称性，这意味着可以通过研究反向反应来推断正向反应的机制。这一原理在本研究中得到了应用，通过对Tfu_1647的反向反应进行分析，我们得以更全面地理解其催化过程中的关键步骤。

Tfu_1647的结构解析揭示了其底物结合口袋的详细构型，为后续的理性设计提供了基础。通过比较不同变体的结构和功能特性，我们发现，扩大底物结合口袋并调整局部静电势是提升催化效率的有效策略。这一策略不仅适用于Tfu_1647，也可能适用于其他ACADs，特别是那些具有较大底物结合口袋的酶。此外，Tfu_1647的催化效率提升可能对己二酸的合成具有重要影响，因为该反应是己二酸生物合成的关键步骤之一。

本研究的成果对于推动ACADs在生物合成中的应用具有重要意义。首先，Tfu_1647的晶体结构为理解其催化机制提供了直观的三维视角，有助于揭示其对不同底物的识别机制。其次，通过半理性设计策略，我们成功提升了Tfu_1647对6C-辅酶A的催化效率，为工业生产中高产己二酸提供了新的酶工程手段。最后，本研究还为其他ACADs的理性设计提供了参考，特别是在如何通过结构改造来优化底物特异性方面。

Tfu_1647的结构信息不仅对己二酸生物合成具有直接应用价值，还可能为其他碳骨架修饰反应提供理论支持。例如，在生物制造领域，通过调控ACADs的底物特异性，可以实现对特定碳链长度化合物的高效合成，从而满足不同工业需求。此外，Tfu_1647的结构特征也可能为设计具有更广泛底物适应性的ACADs提供思路，使其能够在不同底物条件下保持较高的催化效率。

在实验方法上，我们采用了多种技术手段，包括晶体结构解析、分子动力学模拟、自由能计算以及生化实验分析。这些方法的结合使得我们能够从多个层面验证Tfu_1647的结构和功能特性。例如，通过晶体结构解析，我们确定了Tfu_1647的三维构型及其与辅酶FAD的相互作用；通过分子动力学模拟，我们评估了不同变体在不同底物条件下的动态行为；通过自由能计算，我们量化了底物结合口袋的优化对催化效率的影响；而通过生化实验，我们验证了Tfu_1647在实际反应条件下的催化性能。

在研究过程中，我们还发现了一些关键的结构特征。例如，Tfu_1647的底物结合口袋在结构上具有一定的可变性，这使得其能够适应不同长度的底物。然而，这种可变性也带来了对底物特异性的挑战，因为过宽的结合口袋可能导致对非目标底物的识别能力下降。因此，在进行结构改造时，我们需要在扩大结合口袋和保持底物特异性之间找到平衡点。Tfu_1647 Thr370Gln突变体的成功案例表明，通过精确的结构修饰，可以在不牺牲特异性的情况下显著提高催化效率。

此外，我们还对Tfu_1647与其他ACADs的结构差异进行了比较分析。结果显示，尽管Tfu_1647与其他MCADs在结构上具有高度相似性，但其底物结合口袋的构型和局部静电势分布存在显著差异。这些差异可能与其对6C-辅酶A的偏好性有关，也可能解释了其在RADP中的限速作用。因此，深入研究这些结构差异，有助于我们更好地理解ACADs的催化机制，并为后续的酶工程提供理论依据。

在实际应用中，Tfu_1647的催化效率提升可能对生物制造过程产生深远影响。例如，在己二酸的生产中，提高Tfu_1647的催化活性可以显著缩短反应时间，降低能耗，并提高产物收率。此外，Tfu_1647的优化也可能促进其他MDCAs的合成，从而拓展其在生物制造中的应用范围。因此，本研究不仅在理论上深化了我们对ACADs结构和功能的理解，也在实践中为工业应用提供了新的可能性。

总之，Tfu_1647的结构解析和功能优化为ACADs的理性设计提供了重要的基础。通过半理性设计策略，我们成功提升了其对6C-辅酶A的催化效率，这一成果有望在生物合成领域产生广泛影响。未来的研究可以进一步探索Tfu_1647与其他ACADs的协同作用，以及其在不同反应条件下的表现，以期实现更高效的碳骨架修饰反应。同时，随着结构预测工具的不断进步，如AlphaFold3和Chai-1，我们期待能够利用这些工具进行更系统的结构-功能研究，为ACADs的工程改造提供更全面的支持。