基于SCAR标记的塞维利亚根结线虫分子诊断技术开发与应用

《Phytopathology Research》：Molecular diagnosis of the Seville root-knot nematode Meloidogyne hispanica based on SCAR marker

本研究针对检疫性有害生物塞维利亚根结线虫(Meloidogyne hispanica)缺乏快速特异性检测方法的难题，通过将RAPD标记转化为SCAR标记，成功开发出可特异性扩增385-bp片段的SCAR-PCR方法。该技术能检测所有发育阶段线虫及带菌土壤，灵敏度达单条雌虫DNA的1/1280，为田间监测和口岸检疫提供了可靠工具。

　　

在全球农业生产中，根结线虫(Meloidogyne spp.)堪称最具破坏力的植物病原物之一。这些微小的蠕虫通过侵染作物根系形成巨型细胞，导致植株矮化、萎蔫甚至死亡，每年造成数十亿美元的经济损失。在众多根结线虫种类中，塞维利亚根结线虫(Meloidogyne hispanica)近年来尤为引人关注——这种最初仅在西班牙南部桃树上发现的病原物，如今已扩散至全球四大洲，其寄主范围从热带果树扩展到辣椒、番茄等重要蔬菜作物，甚至能突破作物的抗性基因防线。

更令人担忧的是，传统形态学鉴定方法难以将M. hispanica与分子I组的其他常见根结线虫（如南方根结线虫M. incognita、花生根结线虫M. arenaria等）准确区分。研究人员发现，在16个关键形态特征中，有超过12个特征存在重叠现象。虽然线粒体DNA(mtDNA)限制性片段长度多态性(RFLP)分析曾被用于鉴别，但该方法操作繁琐、耗时长且需要大量高质量DNA。更棘手的是，核糖体内部转录间隔区(ITS)和细胞色素c氧化酶亚基I(mtCOI)等常用分子标记也无法实现物种特异性区分。由于基因组信息的缺乏，这种具有重大检疫意义的线虫长期缺乏快速准确的检测手段。

为解决这一技术瓶颈，中国热带农业科学院环境与植物保护研究所的研究团队在《Phytopathology Research》上发表了创新性研究成果。他们另辟蹊径，采用随机扩增多态性DNA(RAPD)标记技术，成功开发出基于序列特征化扩增区域(SCAR)的分子检测方法，为这种"隐形杀手"的精准监测提供了新利器。

关键技术方法方面，研究团队首先从海南辣椒田和藜科杂草中分离获得M. hispanica种群，通过15条RAPD引物筛选发现OPC-06引物能稳定产生约500 bp的特异性条带。将该片段克隆测序后设计三对SCAR引物，经特异性验证最终确定Mhi-1F/R为最佳引物组合，其扩增的385-bp片段仅存在于M. hispanica基因组。灵敏度测试采用单条雌虫和二期幼虫(J2)DNA进行梯度稀释，并通过人工接虫土壤样本验证田间适用性。

筛选靶向M. hispanica的RAPD引物

研究人员采用15条随机引物对M. hispanica(Mhi01)基因组DNA进行扩增，发现OPC-06引物产生的电泳图谱最为清晰：在750 bp处出现微弱条带，而在500 bp处呈现明亮的主条带。这种简单的条带模式为后续标记开发提供了理想模板。

M. hispanica靶向RAPD片段表征与克隆

通过不同寄主来源的M. hispanica种群验证，OPC-06引物的扩增结果具有良好重复性。更重要的是，该引物在其它植物寄生线虫（包括多种根结线虫和胞囊线虫）中均未产生类似条带，表明500 bp片段具有物种特异性。测序结果显示该片段长度为452 bp，NCBI数据库比对未发现高度同源序列，证实其作为特异性标记的潜力。

M. hispanica特异性SCAR标记开发与验证

基于RAPD片段序列设计的三对SCAR引物中，Mhi-2F/R和Mhi-3F/R在多个非目标线虫物种中出现交叉扩增，而Mhi-1F/R引物对仅在所有M. hispanica种群中稳定扩增出385-bp条带，且与其它测试线虫无任何交叉反应，证明其具备严格的物种特异性。

SCAR引物检测效能与灵敏度评估

该方法能成功检测M. hispanica所有发育阶段（卵、寄生前J2、寄生期J2、三/四龄幼虫、雌成虫和雄成虫）的DNA。在人工接虫土壤实验中，仅需0.5克土壤即可检测到1条J2线虫。灵敏度测试显示，该方法可检测到单条雌虫DNA的1/1280稀释液和单条J2 DNA的1/160稀释液，展现出极高的检测灵敏度。

这项研究成功将不稳定的RAPD标记转化为稳定的SCAR标记，解决了M. hispanica缺乏特异性分子检测工具的难题。与需要预先知道靶标序列的传统PCR方法不同，该策略特别适用于基因组信息匮乏的物种。开发的SCAR-PCR方法不仅操作简便、成本低廉，更能直接应用于土壤样本检测，这对于作物种植前的风险评估和疫区动态监测具有重要实践价值。值得注意的是，该方法对单条线虫所有发育阶段的检测能力，使其在口岸检疫、种苗调运监管等场景中展现出独特优势。

随着全球种苗贸易日益频繁，M. hispanica在中国乃至全球的扩散风险持续加剧。这项研究成果为防控这种检疫性线虫提供了关键技术支撑，将有助于建立早期预警体系，防止其通过受侵染的土壤或种苗传播。该检测方法的推广应用，对保障农业生产安全、维护农产品贸易健康发展具有重要意义。