氨氯地平通过降解EGFR抑制胶质瘤干细胞的新机制研究

《Cell Death Discovery》：Amlodipine exerts inhibitory effects against glioma stem cells through degrading EGFR and down-regulating its downstream pro-survival pathways

本刊推荐：为克服胶质母细胞瘤(GBM)治疗抵抗难题，研究人员探索了降压药氨氯地平靶向胶质瘤干细胞(GSCs)的作用机制。研究发现氨氯地平可特异性结合EGFR并诱导其通过脂筏介导的内吞作用进入溶酶体降解，从而抑制EGFR/Akt/mTOR等下游促生存通路，显著抑制GSCs的干性维持、自我更新和颅内成瘤能力。该研究为GBM的靶向治疗提供了老药新用的创新策略。

　　

在神经肿瘤领域，胶质母细胞瘤(GBM)始终是悬在患者和医生头上的"达摩克利斯之剑"。作为成人中最常见的恶性原发性脑肿瘤，GBM具有高度侵袭性、治疗抵抗性强和复发迅速的特点，患者中位总生存期仅约15个月。这种治疗困境的根源，与一群特殊的细胞群体——胶质瘤干细胞(GSCs)密切相关。GSCs具有自我更新、多向分化和高致瘤性等干细胞特性，被认为是GBM治疗抵抗和复发的重要根源。尽管针对GSC的Wnt/β-catenin、Hedgehog、JAK/STAT等信号通路靶向治疗策略不断涌现，但临床转化效果甚微。在这种背景下，药物重定位策略——为已有临床药物寻找新适应症，成为突破GSC治疗瓶颈的新希望。

氨氯地平作为经典的二氢吡啶类钙通道阻滞剂(CCB)，长期用于高血压治疗。近年研究发现其具有独立于CCB活性的抗肿瘤作用，如在乳腺癌和肺癌中通过抑制EGFR磷酸化发挥疗效，但其对GSC的具体作用及机制尚不明确。本研究首次系统揭示了氨氯地平通过创新机制靶向降解EGFR，有效抑制GSC的新作用，为GBM治疗提供了新视角。相关成果发表于《Cell Death Discovery》期刊。

研究采用的主要技术方法包括：CCK-8法和Edu染色检测细胞活力和增殖；三维肿瘤球体侵袭实验评估侵袭能力；肿瘤球形成实验分析自我更新能力；流式细胞术检测细胞周期和凋亡；蛋白质印迹法(Western blot)分析信号通路蛋白表达；免疫共沉淀和免疫荧光法研究EGFR内化和降解机制；分子对接模拟药物-靶点相互作用；以及GSC来源的颅内异种移植模型评估体内抗肿瘤效果。

Amlodipine exhibited precise inhibitory effects on the viability, proliferation, and invasiveness of GSCs

研究人员通过CCK-8实验发现，氨氯地平可剂量和时间依赖性地显著抑制GSC23和GSC11细胞的活力，IC₅₀值分别为34.48μM和28.49μM，而对普通胶质瘤细胞和星形胶质细胞影响轻微。EdU染色显示氨氯地平显著抑制GSC增殖，三维肿瘤球侵袭实验表明其可剂量依赖性地减少GSC的侵袭距离和面积。

Amlodipine induced apoptosis of GSCs and arrested cell cycle of GSCs in G0/G1 phase

TUNEL染色和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术显示氨氯地平可剂量依赖性地诱导GSC凋亡。Western blot证实凋亡相关蛋白cleaved PARP、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax表达上调，而Bcl-2下调。同时，氨氯地平处理使GSC阻滞在G0/G1期，Cyclin D1表达降低。

Amlodipine inhibited stemness and self-renewal of GSCs

肿瘤球形成实验显示氨氯地平处理7天后，GSC球体的数量和大小显著减少。干细胞标志物CD133和SOX2在mRNA和蛋白水平均明显下调，而分化标志物GFAP上调，表明氨氯地平有效抑制了GSC的干性特征。

Amlodipine altered biological characteristics of GSCs through suppressing EGFR and its downstream pro-survival pathways,independent of CCB activity

研究排除了氨氯地平通过CCB活性发挥作用的可能性，因为其他二氢吡啶类CCB和钙螯合剂均未产生类似效果，且L型钙通道激动剂无法逆转其抑制作用。分子对接预测氨氯地平与EGFR具有高结合亲和力(-5.8 kcal/mol)。实验证实氨氯地平可剂量和时间依赖性地降低EGFR总蛋白和磷酸化水平，并抑制下游p-Akt、p-mTOR、p-STAT3和p-ERK信号。

Amlodipine enhanced EGFR degradation through activating endolysisosomal pathway

qRT-PCR显示氨氯地平不影响EGFR mRNA水平。环己酰亚胺(CHX)追踪实验表明氨氯地平促进EGFR降解而非抑制其合成。免疫共沉淀证明蛋白酶体途径不参与此过程，而溶酶体抑制剂Baf A1可逆转氨氯地平介导的EGFR降解和下游信号抑制。免疫荧光共定位显示EGFR与溶酶体标志物LAMP1共定位。

Amlodipine promoted EGFR endocytosis via lipid raft

免疫荧光显示氨氯地平处理导致EGFR在胞质内聚集，膜上EGFR减少。机制研究表明，clathrin内吞抑制剂Pitstop2不能抑制此过程，而脂筏破坏剂MβCD可逆转氨氯地平诱导的EGFR内化和下游信号抑制，表明氨氯地平通过脂筏依赖、clathrin非依赖途径促进EGFR内吞。

Akt agonist reversed the antitumor effects of amlodipine on GSCs

Akt激动剂SC79可部分逆转氨氯地平对p-Akt的抑制，并挽救GSC的活力、增殖、侵袭、自我更新能力，减少凋亡，证实EGFR/Akt/mTOR通路抑制是氨氯地平抗GSC作用的核心机制。

Amlodipine repressed intracranial growth of GSCs

体内实验显示，氨氯地平腹腔注射可显著抑制GSC来源的颅内异种移植瘤生长，延长荷瘤小鼠生存期。SC79可部分逆转此效应。免疫组化和Western blot证实氨氯地平处理组肿瘤组织中EGFR、p-Akt、CD133和SOX2表达降低。

本研究系统阐明了氨氯地平通过创新机制靶向GSC的作用：与EGFR高亲和力结合，触发脂筏介导的内吞和溶酶体降解，从而抑制EGFR/Akt/mTOR等下游促生存通路。该发现不仅揭示了氨氯地平独立于CCB活性的抗肿瘤新机制，还为GBM治疗提供了老药新用的创新策略。值得注意的是，氨氯地平具有良好的血脑屏障穿透性，实验中未观察到明显毒副作用，具有较好的临床转化前景。然而，氨氯地平对肿瘤血管生成的影响、与替莫唑胺(TMZ)的协同效应、以及与Hippo-YAP/TAZ通路的相互作用等问题仍需进一步探索。该研究为克服GSC治疗抵抗提供了新思路，展现了氨氯地平作为GBM靶向治疗药物的巨大潜力。