M2型巨噬细胞通过缓解内质网应激削弱冷大气等离子体对肺癌细胞的杀伤作用

《Cell Death Discovery》：M2 polarization of macrophage protects the lung cancer cells from cold atmospheric plasma via alleviating endoplasmic reticulum stress

本研究针对冷大气等离子体(CAP)在复杂肿瘤微环境(TME)中疗效受限的问题，开展了巨噬细胞与肺癌细胞共培养模型下CAP抗肿瘤效应的机制探索。研究发现CAP诱导巨噬细胞M2极化后释放IL-10，通过激活STAT1/STAT3信号通路缓解肿瘤细胞内质网应激(ER stress)，从而抑制CAP诱导的细胞程序性死亡（包括凋亡、焦亡和自噬）。该研究揭示了TME中免疫细胞对CAP疗效的干扰机制，为CAP肿瘤治疗的临床转化提供了重要理论依据。

　　

在肿瘤治疗领域，冷大气等离子体(CAP)技术因其能够产生大量活性氧/活性氮物种(ROS/RNS)，直接诱导肿瘤细胞多种死亡方式而备受关注。然而，既往研究多局限于体外单层肿瘤细胞模型，忽略了肿瘤微环境(TME)中免疫细胞与肿瘤细胞复杂的相互作用。特别是在TME中占比最高的巨噬细胞，其可塑性极强，在不同刺激下可极化为促进肿瘤生长的M2型或抑制肿瘤的M1型，但CAP如何影响巨噬细胞极化及其对CAP疗效的调节作用尚不明确。这种认知空白严重制约了CAP技术的临床转化应用。

为了填补这一空白，研究人员在《Cell Death Discovery》上发表了最新研究成果，他们建立了一套巨噬细胞与肺癌细胞（Calu-1, H1299, H1975）的Transwell共培养体系，模拟体内TME。通过细胞活力检测(CCK-8)、碘化丙啶(PI)染色、流式细胞术、蛋白质印迹(Western blot)、RNA测序(RNA-seq)以及小鼠肿瘤异种移植模型等多种技术手段，系统探究了CAP在更接近生理状态的TME模型中的抗肿瘤效果及其分子机制。

研究主要应用了以下关键技术方法：利用常压介质阻挡放电(DBD)设备产生CAP并制备等离子体活化培养基(PAM)；通过Transwell共培养系统研究巨噬细胞与肺癌细胞的相互作用；采用流式细胞术检测巨噬细胞表面标志物（CD80/CD206）以分析极化状态；通过RNA-seq进行转录组学分析筛选差异表达基因；使用蛋白质印迹法检测关键信号通路蛋白（如STAT1/STAT3, PERK, eIF2α）及其磷酸化水平，以及细胞死亡相关蛋白（如cleaved Caspase-3, cleaved PARP, LC3-II, cleaved GSDME）的表达；利用特异性siRNA敲低IL-10受体1(IL-10R1)进行功能验证；并利用裸鼠肿瘤异种移植模型进行体内疗效评估。

巨噬细胞显著降低了CAP对肿瘤细胞的杀伤作用

研究人员首先发现，CAP（30秒处理）对单独培养的M0巨噬细胞活力影响不大，却能显著降低单独培养的肺癌细胞Calu-1的活力，并诱导大量细胞死亡。然而，在共培养体系中，巨噬细胞的存在显著减弱了CAP对Calu-1细胞的杀伤作用。这一现象在H1299和H1975细胞中也得到验证，表明巨噬细胞分泌的某种因子保护了肿瘤细胞。

CAP诱导的巨噬细胞M2极化减弱了其杀伤作用

进一步研究表明，CAP处理能诱导单独培养或共培养的巨噬细胞向M2型极化（CD206+细胞增多）。功能实验发现，与M1型巨噬细胞共培养的肺癌细胞对CAP依然敏感，而与M2型巨噬细胞共培养的肺癌细胞则受到明显保护，其活力远高于单独CAP处理的细胞。这证实了M2极化在削弱CAP疗效中的关键作用。

巨噬细胞通过IL-10-STAT1/STAT3通路发挥保护作用

通过细胞因子筛查，研究人员发现CAP处理的巨噬细胞中IL-10和TGF-β1的转录水平显著上调。外源性添加IL-10能模拟巨噬细胞的保护效应，而TGF-β1则不能。更重要的是，利用siRNA敲低肺癌细胞上的IL-10R1后，巨噬细胞的保护作用被显著消除。机制上，IL-10通过激活肺癌细胞内的STAT1和STAT3磷酸化，而非JAK1，来传递保护信号。使用STAT1抑制剂Fludarabine或STAT3抑制剂Stattic均能逆转巨噬细胞的保护作用。

IL-10-STAT1/STAT3轴通过缓解CAP诱导的内质网应激保护肿瘤细胞

RNA-seq分析显示，与单独培养相比，共培养的肺癌细胞在CAP处理后，内质网蛋白合成、PERK介导的内质网应激反应等通路显著富集。共培养细胞中ER应激关键基因（PERK, ATF4）的转录水平和蛋白磷酸化水平（p-PERK, p-eIF2α）均显著降低。使用ER应激抑制剂4-PBA能保护单独培养的细胞免受CAP杀伤，而ER应激激动剂Tunicamycin(TM)则能削弱共培养细胞的存活优势。外源性IL-10可降低CAP引起的ER应激，而STAT1/STAT3抑制剂则能增强共培养细胞的ER应激水平，证实了IL-10-STAT1/STAT3轴通过缓解ER应激发挥作用。

巨噬细胞通过缓解内质网应激抑制CAP诱导的凋亡、焦亡和自噬

CAP能同时诱导肺癌细胞发生凋亡（cleaved Caspase-9, Caspase-3, PARP）、焦亡（cleaved GSDME）和自噬（LC3-II/I）。然而，在共培养体系中，这些细胞死亡途径的激活均被显著抑制。ER应激抑制剂4-PBA能模拟巨噬细胞的保护作用，抑制CAP诱导的多种死亡方式；而ER应激激动剂TM则能恢复共培养细胞中这些死亡途径的激活水平，表明ER应激是CAP诱导多种程序性细胞死亡的核心枢纽。

巨噬细胞在体内减弱CAP的肿瘤抑制效果

体内实验进一步证实了上述发现。与直接使用CAP活化培养基(PAM)处理相比，使用经CAP处理后的巨噬细胞条件培养基(PA-MCM)处理的小鼠肿瘤体积更大，肿瘤细胞凋亡（TUNEL阳性）减少，增殖（Ki67阳性）增强，表明巨噬细胞在体内同样能削弱CAP的抗肿瘤效果。

本研究揭示了一个在CAP治疗中未被充分认识的调控级联反应：CAP诱导巨噬细胞M2极化→M2巨噬细胞释放IL-10→IL-10通过其受体激活肿瘤细胞内STAT1/STAT3信号通路→该通路缓解CAP引起的ER应激→恢复细胞内稳态→抑制多种程序性细胞死亡（凋亡、焦亡、自噬）。这一发现不仅深化了对CAP复杂生物学效应的理解，更重要的是，它揭示了TME中免疫细胞（特别是M2型巨噬细胞）可能成为CAP临床疗效的“双刃剑”，在发挥直接杀伤作用的同时，也可能被肿瘤细胞“利用”而产生适应性抵抗。这为CAP的临床应用提出了重要警示，并提示联合使用能够调控巨噬细胞向M1极化的化疗药物，可能是提高CAP疗效的潜在策略。该研究为开发更有效的CAP肿瘤治疗方案提供了坚实的理论基础和新的思路。