LINC01198通过TAOK1/2激活Hippo信号通路促进IL-1β自分泌驱动黑色素瘤威罗菲尼耐药性研究

《Cell Death Discovery》：LINC01198 activates Hippo signaling to stimulate IL-1β autocrine for driving vemurafenib resistance by associating with TAOK1/2 in melanoma

本研究针对威罗菲尼（VEM）治疗BRAFV600E突变黑色素瘤易产生耐药性的临床难题，通过转录组测序发现LINC01198是唯一在急性和稳定耐药细胞中均上调的LncRNA。机制研究表明，LINC01198直接结合TAOK1/2抑制其磷酸化，通过TAOK/LATS轴激活Hippo信号通路，促进YAP/TAZ核转位，进而转录上调IL-1β表达和分泌，最终导致威罗菲尼耐药。该研究不仅揭示了LINC01198作为耐药关键驱动因子，更为克服黑色素瘤靶向治疗耐药提供了新的联合治疗策略。

　　

在皮肤癌的凶险谱系中，黑色素瘤虽然仅占1%的发病率，却凭借其高度恶性和快速进展的特性，导致了高达17.5%的皮肤癌相关死亡率，成为皮肤癌领域最致命的威胁。随着全球发病率和死亡率的持续攀升，针对BRAF^V600E突变的靶向药物威罗菲尼为不可切除和转移性黑色素瘤患者带来了革命性的治疗突破。然而，令人遗憾的是，大多数患者在治疗一年内就会产生耐药性，这一临床难题严重制约了治疗效果并影响了患者的生存质量。

靶向药物耐药性的产生机制复杂多样，可能涉及靶基因的进一步突变、下游通路的重新激活、旁路信号的开启或细胞可塑性的增强等多种因素。在众多信号通路中，Hippo-YAP/TAZ信号通路被证实在对靶向治疗、化疗、放疗和免疫治疗的耐药性诱导中发挥着重要作用。然而，这一旁路机制在黑色素瘤中如何被激活，特别是如何导致威罗菲尼耐药，仍然存在争议且机制不明。

长链非编码RNA（LncRNAs）作为长度超过200个核苷酸的非编码转录本，在病理生理过程中扮演着多样化角色。研究表明LncRNAs深度参与细胞周期、细胞焦亡、药物外排系统、上皮-间质转化和癌症干细胞生成等与耐药性相关的生物学过程。尽管LncRNAs在肿瘤耐药中具有重要意义，但它们在黑色素瘤耐药中的作用和机制仍待深入探索。

正是在这样的背景下，南方医科大学的研究团队在《Cell Death Discovery》上发表了重要研究成果。为了探索驱动黑色素瘤威罗菲尼耐药的关键因素，研究人员通过剂量递增法成功构建了威罗菲尼耐药的A375黑色素瘤细胞株（A375R）。实验证实，与亲代细胞相比，耐药细胞的IC₅₀显著增加（耐药指数RI>5），且威罗菲尼处理后仍保持较高的细胞活力和克隆形成能力。

通过两组转录组测序比较分析——一组比较亲代A375细胞与威罗菲尼耐药A375R细胞，另一组比较威罗菲尼急性处理与mock处理的A375细胞，研究人员惊人地发现LINC01198是唯一在两种比较中均显著上调的LncRNA。这一发现在qPCR实验中得到了进一步验证，表明LINC01198在耐药细胞和威罗菲尼处理的细胞中均显著高表达。

功能实验表明，通过CRISPR-Cas9技术敲除LINC01198或通过RNA干扰技术敲低其表达，都能显著增强威罗菲尼耐药细胞对药物的敏感性，降低细胞活力和克隆形成能力。相反，过表达LINC01198则进一步增强了耐药性。这些结果明确了LINC01198在促进威罗菲尼耐药中的关键作用。

机制探索方面，研究人员通过RNA pulldown结合高效液相色谱-质谱分析发现，LINC01198直接与TAOK1和TAOK2结合。进一步的免疫共沉淀和共聚焦显微镜观察证实了这种相互作用。重要的是，LINC01198的结合抑制了TAOK1/2的磷酸化，进而减弱了下游LATS1/2的磷酸化，最终导致Hippo信号通路的激活。

Hippo信号通路的激活促使YAP/TAZ从磷酸化状态转变为非磷酸化状态，从而能够进入细胞核发挥转录共激活因子功能。核质分离实验和免疫荧光染色结果显示，在威罗菲尼耐药细胞中，YAP/TAZ显著富集于细胞核内。通过染色质免疫沉淀实验，研究人员发现转录因子TEAD4能够结合到IL1B基因的启动子区域，而YAP/TAZ与TEAD4的结合进一步增强了IL1B的转录活性。

细胞因子IL-1β作为这一信号通路的最终效应分子，在耐药机制中发挥着至关重要的作用。实验表明，外源性重组人IL-1β能够剂量依赖性地增强威罗菲尼耐药细胞的活力，而敲低IL1B则显著抑制了细胞耐药性。值得注意的是，威罗菲尼耐药细胞中IL-1β受体的表达也协同上调，这表明耐药细胞对自分泌IL-1β具有更强的响应能力。

为了验证体外研究结果，研究人员构建了小鼠异种移植瘤模型。将A375R细胞和LINC01198敲除的A375R细胞皮下注射到裸鼠体内，并进行威罗菲尼治疗。结果显示，敲除LINC01198显著延缓了肿瘤生长，导致更小的肿瘤体积。肿瘤组织分析进一步证实，LINC01198敲除组中p-TAOK和p-LATS水平上调，而IL-1β表达下降，这与体外实验结果一致。

临床数据分析更是为这一机制提供了有力支持。通过对GEO和TCGA数据库中黑色素瘤患者样本的分析，发现在威罗菲尼治疗无应答的患者中，LINC01198和IL1B的表达均显著高于治疗敏感患者，且两者表达呈正相关。这一发现将基础研究结果与临床实践紧密联系起来，强调了LINC01198-IL-1β轴在黑色素瘤威罗菲尼耐药中的临床意义。

本研究采用了一系列关键技术方法：通过剂量递增法构建威罗菲尼耐药细胞模型；利用转录组测序筛选差异表达基因；运用CRISPR/Cas9基因编辑和RNA干扰技术进行功能验证；采用RNA pulldown结合质谱分析鉴定LINC01198相互作用蛋白；通过细胞核质分离和免疫荧光分析蛋白定位；使用染色质免疫沉淀技术研究转录因子结合；建立小鼠异种移植瘤模型进行体内验证；并分析GEO和TCGA临床数据库验证临床相关性。

LINC01198是唯一在急性和稳定耐药细胞中均上调的LncRNA

通过转录组测序比较威罗菲尼耐药A375R细胞与亲代A375P细胞，以及威罗菲尼急性处理与mock处理的A375细胞，发现LINC01198是唯一在两种比较中均显著上调的LncRNA。qPCR验证表明LINC01198在耐药细胞和威罗菲尼处理细胞中表达均显著升高。

LINC01198促进黑色素瘤威罗菲尼耐药

功能实验表明，敲除或敲低LINC01198能显著增强威罗菲尼耐药细胞对药物的敏感性，降低细胞活力和克隆形成能力。而过表达LINC01198则进一步增强了耐药性，证实了LINC01198在促进威罗菲尼耐药中的关键作用。

转录组测序揭示LINC01198正向调控IL1B表达

通过维恩分析耐药组上调基因与LINC01198敲除组下调基因，发现IL1B是唯一的共同基因。实验验证表明LINC01198敲除或敲低导致IL1B表达下降，而过表达LINC01198则上调IL1B表达。耐药细胞中IL-1β分泌量和受体表达均上调。

IL-1β通过增强黑色素瘤细胞活力促进威罗菲尼耐药

外源性IL-1β能剂量依赖性地增强耐药细胞活力，而敲低IL1B则抑制细胞耐药性。添加IL-1β能恢复LINC01198敲低导致的细胞活力下降，证明IL-1β在维持耐药性中的关键作用。

LINC01198通过TAOK1/2调控Hippo信号通路

LINC01198主要定位于细胞质，通过RNA pulldown和质谱分析发现其直接结合TAOK1/2。这种结合抑制了TAOK1/2磷酸化，进而减少LATS1/2磷酸化，激活Hippo信号通路，促进YAP/TAZ核转位。

LINC01198调控的IL-1β表达依赖于TAOK1/2调控的Hippo信号通路

TEAD4能结合IL1B启动子区域，YAP/TAZ与TEAD4形成复合物促进IL1B转录。使用Verteporfin抑制YAP-TEAD相互作用或TRULI抑制LATS1/2，均影响IL-1β表达和细胞耐药性。

LINC01198在体内促进黑色素瘤威罗菲尼耐药

小鼠体内实验表明，敲除LINC01198显著延缓肿瘤生长，肿瘤组织中p-TAOK和p-LATS水平上调，IL-1β表达下降，验证了体外发现的机制在体内的适用性。

LINC01198和IL1B在威罗菲尼治疗无应答的黑色素瘤患者中高表达

临床数据分析显示，威罗菲尼治疗无应答患者中LINC01198和IL1B表达均显著高于敏感患者，且两者表达正相关，证实了研究发现的临床相关性。

这项研究的意义不仅在于揭示了LINC01198作为威罗菲尼耐药的关键驱动因子，更重要的是阐明了从LncRNA到细胞因子信号的完整调控轴。LINC01198通过结合TAOK1/2蛋白，抑制其磷酸化活性，进而通过TAOK/LATS轴激活Hippo信号通路，促进YAP/TAZ核转位，最终与TEAD4转录因子共同调控IL-1β的表达和分泌，形成自分泌环路维持黑色素瘤细胞的威罗菲尼耐药性。

该研究的创新之处在于首次将LncRNA、Hippo信号通路和细胞因子自分泌机制联系起来，为理解靶向治疗耐药提供了新的视角。从转化医学角度，LINC01198和IL-1β都可能成为预测威罗菲尼疗效的生物标志物，而针对LINC01198的基因沉默技术或IL-1β抑制剂（如已获批临床使用的Canakinumab和Rilonacept）与威罗菲尼的联合治疗策略，可能为克服黑色素瘤耐药提供新的治疗选择。

值得注意的是，细胞因子通常被认为主要由免疫细胞分泌并作用于肿瘤细胞，而本研究强调了肿瘤细胞自身产生的IL-1β在维持耐药性中的重要作用，这一发现拓展了对肿瘤微环境中细胞因子网络的理解。未来研究可以进一步探索LINC01198在免疫细胞中的功能，以及其在调节肿瘤免疫应答中的潜在作用，为黑色素瘤的免疫治疗提供新的思路。

总之，这项研究系统阐明了LINC01198/TAOK/Hippo/IL-1β轴在黑色素瘤威罗菲尼耐药中的核心作用，为克服靶向治疗耐药这一临床难题提供了新的理论基础和治疗策略，在个性化医疗和精准治疗领域具有重要的应用前景。