PADI2通过抑制M2型巨噬细胞的极化作用，加剧了由Mycoplasma ovipneumoniae引起的绵羊肺部损伤

《Veterinary Research》：PADI2 exacerbates Mycoplasma ovipneumoniae-induced lung injury in sheep by suppressing M2 macrophage polarization

巨噬细胞极化受PADI2调控，MO感染通过SP3增强PADI2表达抑制M2型极化并加剧肺损伤，RNA-seq和IHF染色验证了PADI2在肺纤维化中的促炎作用及SP3的调控机制。

　　这项研究探讨了绵羊肺泡巨噬细胞在感染支原体（*Mycoplasma ovipneumoniae*，MO）后的反应机制，特别是PADI2（肽基精氨酸脱亚氨酶2）在其中的作用。研究结果表明，PADI2的表达在MO感染后显著增加，并且这种变化与巨噬细胞的极化状态密切相关。此外，PADI2的表达水平与MO感染负荷之间存在正相关，进一步揭示了其在宿主防御中的潜在调控机制。研究还发现，PADI2的表达可能受到转录因子SP3的调控，这为理解MO感染下巨噬细胞的极化变化提供了新的视角。

### 研究背景与意义

MO感染是全球绵羊养殖地区普遍存在的慢性呼吸道传染病，尤其在集约化养殖系统中更为常见。该病通过空气传播，导致羔羊和成年绵羊出现持续性咳嗽、逐渐消瘦以及间质性肺炎等症状，常常引发继发性细菌感染并导致死亡，给畜牧业带来显著的经济损失。尽管抗生素治疗和疫苗研发在一定程度上缓解了疾病的传播，但MO的抗原变异性和免疫逃逸机制仍限制了现有防控策略的有效性。因此，深入研究MO的致病机制及其与宿主免疫系统的相互作用，成为当前的重要研究方向。

近年来，研究发现MO感染通过调节宿主的表观遗传修饰或关键信号通路重塑局部炎症微环境，但其分子靶点和调控网络尚未完全阐明。PADI2作为一种参与蛋白质精氨酸脱亚氨化的关键酶，其在炎症疾病和感染免疫中的作用引起了广泛关注。研究表明，PADI2特异性区域在野绵羊向家养绵羊的基因渗入过程中增强了其对环境的适应能力，提高了对肺炎的抵抗力。PADI2通过将精氨酸残基转化为瓜氨酸，改变靶蛋白如组蛋白、趋化因子和抗菌肽的结构，从而影响病理过程，包括NF-κB激活和细胞因子风暴的形成。值得注意的是，已有研究指出，PADI2诱导的瓜氨酸化会降低宿主对某些细菌（如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和非典型流感嗜血杆菌）的抗菌能力。这些发现提示，MO感染期间PADI2表达的变化及其在宿主防御反应中的调控机制亟需进一步研究。

### PADI2在MO感染中的作用机制

在本研究中，研究人员对感染MO的绵羊肺泡灌洗液（BALF）进行了RNA测序分析，发现MO组中PADI2的表达显著增加。此外，通过免疫组化荧光（IHF）染色，研究人员发现MO感染组中巨噬细胞数量显著增加，并且广泛分布于肺泡腔内，同时PADI2在巨噬细胞中也表现出正向表达。在体外分离的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中，抑制PADI2的表达诱导了MO感染的巨噬细胞向替代性激活（AAM，M2型）巨噬细胞极化。进一步的实验发现，这种极化过程伴随着抗炎基因IL10以及与组织修复相关的基因（如血管内皮生长因子α、转化生长因子-β和肝细胞生长因子）表达水平的显著升高。在体外共培养系统中，抑制PADI2的表达能够减少肺成纤维细胞中的细胞凋亡和活性氧（ROS）水平，从而减轻MO感染引起的组织损伤。

研究还发现，MO感染负荷与BALF中PADI2的表达水平之间存在正相关。通过双荧光素酶报告系统，研究人员确认了这一过程可能由转录因子SP3调控。SP3属于zf-C2H2家族的转录因子，其在MO感染组中表达显著增加。研究还预测了PADI2上游300 bp区域存在三个可能的SP3结合位点，并通过实验验证了这些结合位点在MO刺激下对PADI2转录的调控作用。这些结果表明，PADI2在MO感染中的表达受到SP3的调控，而这种调控机制可能在宿主防御反应中发挥重要作用。

### 巨噬细胞极化与组织修复的关系

巨噬细胞在宿主免疫反应中具有重要的调节作用，其极化状态对组织损伤和修复具有深远影响。研究发现，MO感染导致巨噬细胞极化偏向M1型（经典激活型），而抑制PADI2的表达则促进其向M2型（替代激活型）极化。M1型巨噬细胞通常表现出较强的促炎作用，分泌如IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子，同时增强细胞凋亡和细胞粘附功能，可能加重肺组织损伤。相反，M2型巨噬细胞则具有抗炎、组织修复和免疫调节的功能，能够分泌IL-10、VEGFA、TGF-β和HGF等因子，促进组织修复和抗炎反应。

研究还发现，PADI2的表达不仅影响巨噬细胞的极化状态，还通过调控这些极化相关的基因表达，影响肺组织的修复能力。例如，在MO感染的情况下，PADI2的表达会抑制M2型巨噬细胞的极化，从而降低组织修复相关基因的表达，导致肺组织损伤加重。这一发现为理解MO感染下巨噬细胞的极化变化提供了新的线索，也为寻找有效的宿主防御策略提供了可能的靶点。

### 实验方法与技术细节

为了深入研究MO感染对巨噬细胞的影响，研究人员建立了MO感染的绵羊模型，并在感染29天后收集BALF进行转录组分析。通过RNA测序，研究人员发现MO感染导致PADI2表达显著增加，并且这些变化与“FoxO信号通路”和“AMPK信号通路”密切相关。为了验证这些结果，研究人员使用RT-qPCR对部分差异表达基因进行了验证，结果与RNA测序数据一致，进一步支持了PADI2在MO感染中的重要性。

此外，研究人员通过免疫组化荧光染色观察了肺泡组织中巨噬细胞的分布和PADI2的表达情况。结果显示，MO感染组中巨噬细胞数量显著增加，并且广泛分布于肺泡腔内，而PADI2在这些巨噬细胞中也表现出正向表达。为了进一步研究PADI2对巨噬细胞极化的影响，研究人员在体外分离BMDMs，并使用siRNA抑制PADI2的表达，观察其对巨噬细胞极化状态的影响。结果显示，抑制PADI2的表达能够显著促进M2型巨噬细胞的极化，同时降低促炎因子的表达水平，从而减轻肺组织损伤。

在体外共培养系统中，研究人员将肺成纤维细胞与BMDMs共同培养，观察PADI2表达对肺成纤维细胞的影响。结果显示，PADI2的表达会增加肺成纤维细胞中的ROS水平和细胞凋亡率，而抑制PADI2的表达则显著降低这些指标，表明PADI2在MO感染中可能通过促进炎症反应和细胞凋亡，加重肺组织损伤。这一发现进一步支持了PADI2在MO感染中的关键作用。

### 转录因子SP3的调控作用

为了进一步探讨PADI2在MO感染中的表达调控机制，研究人员利用在线预测工具AnimalTFDB4 v4.0分析了PADI2上游2000 bp区域的转录因子结合位点。结果显示，在MO感染组中，SP3的表达显著增加，而其他转录因子的表达变化则不明显。SP3属于zf-C2H2家族，其在MO感染组中表达数量最多，表明该家族可能在MO感染中发挥重要作用。研究还预测了PADI2上游300 bp区域存在三个可能的SP3结合位点，并通过构建双荧光素酶报告系统验证了这些结合位点在MO刺激下的转录调控作用。实验结果显示，随着MO感染浓度的增加，SP3结合位点的调控作用增强，从而促进PADI2的表达。这一发现表明，SP3可能在MO感染中通过调控PADI2的表达，影响巨噬细胞的极化状态和肺组织的修复能力。

### 研究结论与未来展望

综上所述，本研究通过RNA测序分析表明，MO感染能够显著增加肺泡巨噬细胞中PADI2的表达，并且这种表达变化与巨噬细胞的极化状态密切相关。抑制PADI2的表达能够促进巨噬细胞向M2型极化，从而增强组织修复能力并减轻肺组织损伤。此外，研究还发现，MO感染负荷与PADI2的表达水平之间存在正相关，这一过程可能受到转录因子SP3的调控。这些结果不仅加深了我们对MO感染下巨噬细胞极化状态的理解，也为未来研究PADI2作为增强宿主防御的有效靶点提供了理论依据。

通过本研究，研究人员揭示了PADI2在MO感染中的重要作用，为开发新的治疗策略提供了科学基础。例如，针对PADI2的干预措施可能有助于促进M2型巨噬细胞的极化，从而增强宿主对MO感染的防御能力。此外，PADI2的调控机制可能为基因编辑技术在抗MO感染绵羊中的应用提供新的思路。未来的研究可以进一步探索PADI2在其他病原体感染中的作用，以及其在宿主免疫系统中的广泛影响。这些发现不仅对理解MO感染的致病机制具有重要意义，也为改善绵羊的健康状况和减少经济损失提供了潜在的解决方案。