TNAP通过去磷酸化磷酸胆碱和磷酸乙醇胺调控肝脏甘油三酯输出的新机制

《Communications Biology》：TNAP dephosphorylates phosphocholine and phosphoethanolamine and participates in triglyceride transport from the liver to the bloodstream

本研究揭示了组织非特异性碱性磷酸酶（TNAP）在空腹状态下通过水解磷酸胆碱和磷酸乙醇胺，促进胆碱摄取并参与肝脏甘油三酯（TG）向血液转运的新功能。研究人员通过基因敲除小鼠模型、化学抑制剂干预、代谢组学分析和结构生物学技术，证实TNAP缺陷会导致肝脂肪变性和血清TG降低，其抑制剂SBI-425可急性影响胆碱代谢。该发现不仅阐明了TNAP在脂质代谢中的新作用机制，也为低磷酸酯酶症（HPP）和动脉粥样硬化等疾病的治疗提供了新靶点。

　　

在生命科学领域，组织非特异性碱性磷酸酶（TNAP）长期以来主要因其在骨骼矿化中的作用而被熟知。它通过水解无机焦磷酸盐（PP_i）——一种强效的矿化抑制剂——来促进骨骼形成。然而，TNAP的异常表达也与病理性钙化密切相关，例如动脉粥样硬化斑块钙化，这被认为是疾病进展的标志和严重程度的生物标志物。尽管过去二十年间对动脉粥样硬化斑块钙化进行了大量研究，但其确切的分子触发因素仍不清楚，而越来越多的证据表明TNAP在其中扮演了关键角色。有趣的是，除了在血管壁局部发挥作用外，TNAP也由肝脏释放入血液循环，其水平与代谢综合征和心血管钙化相关。更为复杂的是，肝脏PP_i生成缺陷会导致血管钙化，这暗示TNAP可能通过水解肝脏和/或血管中的PP_i来促进动脉粥样硬化斑块钙化。

然而，科学探索往往带来意想不到的发现。研究人员在利用TNAP抑制剂研究其对动脉粥样硬化模型小鼠斑块钙化的影响时，观察到了一个令人惊讶的现象：抑制TNAP不仅影响了钙化过程，还显著降低了血液中的甘油三酯（TG）和胆固醇水平，并损害了动脉粥样硬化斑块的整个发展过程。这一偶然发现将TNAP的功能从传统的矿化领域引向了脂质代谢这一全新舞台。通过核磁共振（NMR）代谢组学分析，研究人员将磷酸胆碱锁定为TNAP的潜在底物，从而在TNAP活性与脂质转运之间建立了可能的联系。据此，他们提出了一个大胆的假说：TNAP可能是去磷酸化细胞外磷酸胆碱的关键酶，从而使得胆碱能够被肝细胞摄取。细胞内胆碱是合成磷脂酰胆碱（PC）的前体，而PC是极低密度脂蛋白（VLDL）膜的主要磷脂成分，对于VLDL的组装至关重要。VLDL随后被释放到血液中，将脂质输送至外周组织。在这一框架下，TNAP可能构成了细胞外胆碱代谢途径中缺失的一环。

具体而言，TNAP可能在吸收后代谢（即空腹状态）中发挥重要作用。在进食状态下，胆碱从膳食中的含胆碱脂质释放，被肠道细胞吸收，通过门静脉运输并递送给肝细胞。而在空腹状态下，与脂蛋白相关的PC会经历一系列水解反应，依次生成溶血磷脂酰胆碱（lyso-PC）、甘油磷酸胆碱（GPC）、磷酸胆碱和胆碱。TNAP抑制剂所表现出的效应与胆碱缺乏饮食的效果相似，后者会损害PC的产生并导致肝脏脂肪变性。这一假设也得到了TNAP缺陷（Alpl^+/-）小鼠会出现肝脏脂肪变性的观察结果的支持。此外，PC也可以通过磷脂酰乙醇胺（PEA）的甲基化在内源性产生，但这一途径通常不足以完全补偿严重的胆碱缺乏。值得注意的是，在低磷酸酯酶症（HPP）患者中，经常观察到血液和尿液中磷酸乙醇胺水平升高，这提示TNAP可能也参与了磷酸乙醇胺的水解，从而促进细胞对乙醇胺的摄取和随后的磷脂合成。

为了验证TNAP参与胆碱代谢的这一假说，研究团队展开了一系列严谨的实验。他们利用了TNAP缺陷小鼠和野生型小鼠、人和小鼠的血清以及培养的人肝细胞。同时，他们制备了重组人TNAP，以表征其酶活性、三维结构，并深入了解其与磷酸胆碱、磷酸乙醇胺以及TNAP抑制剂的相互作用。在体内和细胞实验中，分别使用了优化用于体内研究的SBI-425和MLS-0038949这两种TNAP抑制剂。

研究首先证实，TNAP缺陷小鼠在出生后11天（离乳前）就已经表现出肝脏TG积累增加和血浆TG水平降低，即早期肝脏脂肪变性。由于Alpl^-/-小鼠无法存活至成年，研究人员在成年野生型小鼠中使用SBI-425进行短期（3小时）TNAP抑制。在空腹小鼠中，TNAP抑制显著降低了血清和肝脏中的胆碱、磷酸胆碱和GPC水平，并且血清胆碱与磷酸胆碱水平呈正相关。尽管胆碱和磷酸胆碱水平下降，但肝脏总PC水平却有增加趋势，并且积累的PC种类与那些主要从肝脏发送到VLDL的脂肪酸种类一致。这些结果表明，TNAP抑制打乱了血液中PC水解为胆碱的整个级联反应，并与PC在肝细胞中的滞留有关。此外，TNAP抑制还引起了肝脏代谢应激的标志，如Il1b和Fgf21转录本水平升高。

为了确定TNAP是否是血液中水解磷酸胆碱和磷酸乙醇胺的关键酶，研究人员在补充了这些底物的人和小鼠血清中进行了实验。结果发现，血清能够将磷酸胆碱逐步转化为胆碱，将磷酸乙醇胺转化为乙醇胺，并且水解速率与血清中TNAP的活性正相关。更重要的是，TNAP抑制剂能够完全抑制胆碱和乙醇胺的形成，直接证明了TNAP在此过程中的核心作用。

与小鼠肝细胞不同，人肝细胞在体内表达TNAP。研究人员在三种人肝细胞系（最终选择HuH-6细胞）中发现，锚定在肝细胞膜上的TNAP同样参与了磷酸胆碱和磷酸乙醇胺的去磷酸化，且该过程约60%可被TNAP抑制剂所抑制，剩余活性可能源于肠源性碱性磷酸酶（IAP）。最关键的功能性实验表明，在胆碱耗尽但补充了磷酸胆碱的培养基中，肝细胞的增殖依赖于TNAP的活性。当TNAP被抑制时，细胞增殖显著降低（57%），而这在直接补充胆碱的培养基中则不受影响。这强有力地表明，TNAP介导的磷酸胆碱去磷酸化对于肝细胞摄取胆碱至关重要。

i）的定量，无论是否存在TNAP抑制剂。B HuH-6细胞在有或无胆碱和磷酸胆碱条件下培养，并在有或无TNAP抑制剂条件下培养后的DNA定量。'>

酶动力学分析显示，重组人和小鼠TNAP均能高效地去磷酸化磷酸胆碱和磷酸乙醇胺。尽管对这两种底物的米氏常数（K_m）高于对PP_i的K_m，但它们的催化效率（k_cat/K_m）却更高，这主要归因于人TNAP对磷酸胆碱和磷酸乙醇胺的k_cat比对PP_i的高8-10倍。这种更高的转换数可能反映了底物电荷的差异：胆碱和乙醇胺带正电，而PP_i带负电。

为了从结构上理解TNAP如何与不同底物结合，研究人员通过X射线晶体学解析了分辨率为3.35 ?的人TNAP结构，并进行了分子对接模拟。对接分析揭示了PP_i和磷酸胆碱两种截然不同的结合模式。PP_i的磷酸基团与活性位点的锌离子（Zn2）配位，并伸向一个小的带正电口袋，与精氨酸残基R168和R184相互作用。而磷酸胆碱则采取完全相反的取向，其带正电的季铵基团嵌入一个主要由酸性残基D109和E452形成的大带负电凹槽中，其磷酸基团则与PP_i类似，与催化锌离子配位。磷酸乙醇胺的结合模式则更具可变性，可能与其缺乏甲基基团以及在不同pH下可呈现不同电离状态有关。这些结构研究表明，TNAP的活性位点可以通过不同的路径容纳带负电的PP_i和带正电的磷酸胆碱。

i的米氏方程表示，即反应速率依赖于底物浓度。B 磷酸胆碱、磷酸乙醇胺和PP_i水解的动力学参数。'>

此外，研究团队还通过冷冻电镜（cryo-EM）单颗粒分析技术解析了TNAP与抑制剂MLS-0038949的复合物结构，以阐明这类磺酰胺类抑制剂的作用机制。结果显示，抑制剂结合在TNAP活性位点的入口处，其para-二甲氧基苯基部分直接位于催化锌离子（Zn2）上方，形成阳离子-π相互作用，从而阻止了包括磷酸胆碱在内的各种TNAP底物的结合。结构比较发现，TNAP活性位点的一些关键残基（如H451）在其他人类碱性磷酸酶同工酶（如IAP、GCAP、PLAP）中是不同的，这解释了MLS-0038949及其衍生物（SBI-425、DS-1211）对TNAP的选择性抑制特性。

i和TNAP抑制剂的相互作用。A 底物在TNAP活性位点中的容纳。B 静电表面图显示电荷分布。C 磷酸乙醇胺在活性位点内取向的两个示例。D TNAP抑制剂MLS-0038949的结构及其与TNAP表面相互作用的整体表示。E, F, G MLS与TNAP活性位点残基的详细相互作用，以及其与IAP的结构比较。'>

本研究主要应用了以下关键技术方法：利用TNAP基因敲除（Alpl^-/-）小鼠模型和药理学抑制剂（SBI-425）进行体内功能研究；通过核磁共振（NMR）代谢组学对小鼠血清、肝脏等组织进行代谢物定量分析；使用体外酶促反应体系（包括人和小鼠血清、重组TNAP蛋白）评估底物水解动力学；利用人源肝细胞系（HuH-6）进行细胞水平的功能验证（增殖实验、底物水解实验）；采用X射线晶体学和冷冻电镜（cry-EM）单颗粒分析解析TNAP及其与抑制剂的复合物三维结构；通过分子对接模拟研究底物（磷酸胆碱、磷酸乙醇胺、PP_i）与TNAP活性位点的结合模式。

本研究结果部分通过上述实验体系得出以下核心结论：TNAP缺陷会导致小鼠早期肝脏脂肪变性和低血脂症；短期抑制TNAP会急性扰乱空腹状态下小鼠血液和肝脏中的胆碱代谢，引起代谢应激；TNAP是人和小鼠血清中水解磷酸胆碱和磷酸乙醇胺的关键酶；肝细胞膜上的TNAP对其增殖和胆碱摄取至关重要；重组TNAP能高效催化磷酸胆碱和磷酸乙醇胺的去磷酸化，其催化效率甚至高于对经典底物PP_i的水解；结构生物学研究揭示了TNAP活性位点可通过不同路径结合带相反电荷的底物，并且抑制剂通过阻断活性位点入口发挥广谱抑制作用。

该研究结论和讨论部分强调，TNAP是空腹状态下去磷酸化细胞外磷酸胆碱、从而促进肝细胞胆碱摄取的关键酶。这一功能很可能是全身性的，不仅限于肝脏，脑或骨等组织的细胞也可能依赖TNAP获取胆碱。该发现将TNAP的功能从骨骼矿化拓展至脂质代谢领域，为理解低磷酸酯酶症（HPP）的肝部症状（如部分患者接受重组TNAP治疗后出现肝炎）提供了新视角。同时，对于正在开发TNAP抑制剂用于治疗病理性钙化（如假性弹性黄色瘤、慢性肾病相关心血管钙化）的临床研究具有重要警示意义，需密切关注治疗可能引发的胆碱缺乏及相关代谢紊乱。此外，结构数据表明，特定的TNAP突变可能差异性影响其对不同底物（如PP_i与磷酸胆碱）的水解能力，这或许可以解释HPP患者临床表现的多样性。总之，这项研究揭示了TNAP在生理性脂质分布中的新角色，为相关疾病的机制研究和治疗策略开发开辟了新方向。