4'-羟基查尔酮纳米纤维水凝胶敷料通过TLR/IL-17/TNF通路调控巨噬细胞极化促进糖尿病慢性创面愈合

《Materials Today Bio》：4'-Hydroxychalcone nanofiber hydrogel dressing promotes diabetic chronic wound healing by regulating macrophage polarization via the TLR/IL-17/TNF signaling pathway

本研究针对糖尿病慢性创面愈合困难、炎症反应失调的临床难题，开发了一种负载4'-羟基查尔酮(4HC)的纳米纤维水凝胶敷料(P-4HC)。研究证实P-4HC通过抑制TLR/IL-17/TNF信号通路，促进巨噬细胞从M1型向M2型极化，改善组织缺氧，促进血管新生和胶原沉积，显著加速糖尿病慢性创面愈合。该研究为糖尿病创面治疗提供了新的治疗策略和科学依据。

　　

糖尿病作为一种全球性的慢性代谢性疾病，其患者数量正在快速增长，预计到2045年将比现在增加46%。糖尿病慢性创面，特别是糖尿病足溃疡，是糖尿病最常见且最难治疗的并发症之一。这类创面具有治疗周期长、医疗费用高、复发率高等特点，给患者和社会带来了沉重的负担。与正常创面愈合过程不同，糖尿病创面愈合会经历更长的炎症期，其特征是大量M1型巨噬细胞的持续浸润和促炎细胞因子的过度表达，导致创面难以从炎症阶段过渡到增殖和重塑阶段。因此，如何有效调控糖尿病创面中的过度炎症反应，促进巨噬细胞从促炎的M1表型向抗炎的M2表型转化，成为当前糖尿病创面治疗研究的关键科学问题。

在这一背景下，研究人员将目光投向了具有抗氧化和抗炎活性的天然小分子化合物——4'-羟基查尔酮(4HC)。同时，结合静电纺丝技术制备的纳米纤维和具有良好生物相容性的水凝胶，开发了一种新型的复合伤口敷料。这种敷料结合了纳米纤维的大比表面积和类似细胞外基质的结构优势，以及水凝胶的高吸水性、透气性和药物缓释能力，有望为糖尿病慢性创面提供一个理想的愈合微环境。然而，这种新型敷料——4'-羟基查尔酮纳米纤维水凝胶(P-4HC)——是否能够通过调控巨噬细胞极化来促进糖尿病慢性创面愈合，其具体的作用机制尚不明确。为了回答这些问题，研究人员开展了一项系统的研究，相关成果发表在《Materials Today Bio》上。

为了评估P-4HC的治疗效果和作用机制，研究人员综合运用了多种体外和体内实验技术。在材料表征方面，通过扫描电子显微镜(SEM)观察了纳米纤维和水凝胶的微观结构，并检测了其溶胀率、保水率和药物释放曲线。在生物相容性评价中，采用了细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测细胞活力，活/死细胞染色评估细胞存活状态，并进行了溶血实验。体外功能实验包括：使用活性氧(ROS)检测试剂盒评估抗氧化能力；通过细胞划痕实验和体外血管形成实验评估对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)迁移和成管能力的影响；采用免疫荧光染色和流式细胞术分析巨噬细胞表型转化；利用蛋白质印迹法(Western blotting)检测相关蛋白的表达。在动物实验中，建立了db/db糖尿病小鼠的皮肤全层缺损模型，通过苏木精-伊红(HE)染色、Masson三色染色、免疫组织化学染色（检测COL3A1、HIF-1α、VEGF）和免疫荧光染色（检测CD31、CD86、CD206）来评估创面愈合、胶原沉积、组织缺氧改善程度和血管新生情况。同时，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)和实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测创面组织中细胞因子和基因的表达水平。为了深入探索作用机制，研究人员还对创面组织进行了转录组学分析，包括差异表达基因筛选、基因本体论(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。此外，还使用了TLR9激动剂ODN 1826、IL-17A激动剂SR0987和TRAF1过表达质粒进行通路验证实验。

3.1. P-4HC的表征及其生物相容性和抗氧化特性

研究人员首先成功制备了PLA/4HC复合纳米纤维，并将其均匀分散于水凝胶中形成P-4HC。扫描电镜结果显示，纳米纤维直径均匀，水凝胶呈现三维多孔网络结构，有利于药物渗透和细胞生长。药物释放实验表明，P-4HC能在24小时内释放约70%的4HC，随后缓慢持续释放，达到长效给药的目的。该水凝胶具有良好的溶胀性能和高达95%的保水率，能够有效吸收创面渗出液，为创面愈合提供湿润环境。溶血实验和CCK-8细胞活力检测表明，P-4HC具有良好的血液相容性和细胞相容性。活/死细胞染色显示，与P-4HC共培养的L929细胞绝大多数为活细胞。更重要的是，在ROS诱导实验中，P-4HC，尤其是高剂量组(P-4HC-H)，能显著清除细胞内过多的ROS，表现出强大的抗氧化能力。这些结果为P-4HC作为安全有效的伤口敷料奠定了基础。

3.2. P-4HC促进血管新生和M2型巨噬细胞极化

体外实验证实，P-4HC能促进HUVECs的迁移和成管能力，Western blotting结果也显示其能上调血管内皮标志物CD31和血管内皮生长因子VEGF-A的表达，表明P-4HC具有促血管生成作用。在巨噬细胞极化方面，流式细胞术分析发现，P-4HC处理后的RAW264.7细胞中，M1型巨噬细胞(CD86⁺)比例下降，而M2型巨噬细胞(CD206⁺)比例上升。免疫荧光染色进一步显示，在LPS诱导M1极化后，P-4HC能显著增强M2标志物CD206的荧光强度；而在IL-4诱导M2极化后，P-4HC能有效维持CD206的高表达水平，防止其表型逆转。Western blotting结果一致表明，P-4HC能上调M2型巨噬细胞标志物CD206和Arg-1的表达，下调M1型标志物CD86和iNOS的表达。这些结果强有力地证明，P-4HC能够诱导并维持巨噬细胞向M2表型极化。

3.3. P-4HC增强糖尿病慢性创面愈合

在db/db糖尿病小鼠创面模型中，P-4HC处理显著加速了创面收缩和愈合速度，其效果与阳性药物组相当，并明显优于糖尿病模型组。组织学分析显示，P-4HC-H组创面有更多新生的毛囊、鳞状上皮和角质层，胶原沉积更为致密，COL3A1表达量更高。同时，P-4HC-H能有效改善创面局部缺氧（HIF-1α表达下降），并促进血管新生（VEGF表达上调，CD31阳性信号增强）。对创面组织免疫细胞的分析发现，P-4HC-H组富含M2型巨噬细胞(F4/80⁺CD206⁺)，而模型组则以M1型巨噬细胞(F4/80⁺CD86⁺)为主。ELISA和RT-qPCR检测结果一致表明，P-4HC能降低促炎细胞因子（IL-6, IL-1β, TNF-α）、氧化应激标志物（iNOS, MDA）的水平，提高抗炎细胞因子（IL-4, IL-10）和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。这些结果表明，P-4HC通过调控免疫微环境，减轻炎症反应和氧化应激，促进组织修复和再生。

3.4. 转录组学分析

为了阐明P-4HC的作用机制，研究人员对创面组织进行了转录组学分析。差异表达基因的KEGG通路富集分析显示，TLR信号通路、IL-17信号通路和TNF信号通路是P-4HC处理组中显著下调的主要通路。其中，关键基因TLR9、IL-17A和TRAF1的表达在治疗组中明显降低。随后的RT-qPCR和Western blotting验证了转录组学的结果，证实P-4HC能抑制TLR/IL-17/TNF通路中关键分子（TLR9, IL-17A, IL-17RA, IL-17RC, TRAF1）的表达。

3.5. 阐明P-4HC促进糖尿病慢性创面愈合的机制

为了最终确认TLR/IL-17/TNF通路在P-4HC作用中的核心地位，研究人员在体内外实验中使用了通路激动剂进行干预。在动物实验中，同时使用P-4HC和TLR9激动剂(ODN)、IL-17A激动剂(SR)或TNF通路相关分子TRAF1的激动剂(RSQ)，发现这些激动剂能够逆转P-4HC对创面愈合的促进作用，延缓创面收缩，减少胶原沉积和血管新生，并抑制巨噬细胞向M2表型极化。在细胞实验中，激活TLR9会上调IL-17和TNF通路相关蛋白的表达，并抑制M2极化；激活IL-17A会上调TRAF1和促炎因子表达，抑制M2标志物；而过表达TRAF1则会增强炎症反应，抑制M2极化。这些结果清晰地表明，TLR9、IL-17A和TRAF1在该通路中存在级联放大效应，而P-4HC正是通过抑制这一通路的核心节点，从而发挥其抗炎和促进组织修复的作用。

本研究得出结论，新型伤口敷料P-4HC通过靶向抑制TLR9/IL-17A/TRAF1轴，阻断了TLR/IL-17/TNF信号通路的过度激活，从而成功地将创面局部的巨噬细胞从促炎的M1表型转变为抗炎的M2表型。这一关键的免疫调控作用，有效减轻了糖尿病慢性创面的持续炎症状态，改善了组织缺氧，促进了血管新生和胶原沉积，最终加速了创面愈合进程。该研究不仅开发了一种具有良好应用前景的新型糖尿病创面敷料，更重要的是，从免疫代谢的角度深入揭示了4HC调控巨噬细胞极化的新机制，为理解糖尿病相关并发症的发病机制和开发新的治疗策略提供了重要的理论依据和实验证据。相比于传统的生长因子类药物，P-4HC具有作用多靶点、成本较低、安全性高等潜在优势，为糖尿病慢性创面的临床治疗提供了新的思路和选择。