综述：靶向细胞衰老的药物发现和治疗性纳米策略

《Materials Today Bio》：The drug discovery and therapeutic nano-strategies targeting cellular senescence

本综述系统阐述了靶向细胞衰老的创新治疗策略，重点探讨了如何利用纳米技术增强药物递送效率，为衰老相关疾病（如组织纤维化、慢性伤口等）提供了新的治疗思路。文章深入分析了关键靶点（如TGF-β、TXNDC5、α-SMA）和免疫调控机制（如M1/M2巨噬细胞极化），并介绍了源自再生能力强的物种（如蝾螈）的细胞外基质（A-dECM）作为新型生物材料的巨大潜力。

　　

靶向细胞衰老的药物发现和治疗性纳米策略

摘要

传统的哺乳动物伤口愈合常导致纤维化，形成永久性疤痕并损害皮肤功能。受墨西哥蝾螈卓越再生能力的启发，本研究开发了蝾螈皮肤脱细胞细胞外基质（A-dECM）作为一种促进哺乳动物伤口再生的支架材料。A-dECM保留了其天然的ECM成分，包括富含糖胺聚糖（GAGs）和胶原蛋白的特性，同时通过组织学染色和DNA定量证实有效去除了细胞和免疫原性成分。扫描电子显微镜（SEM）显示完整的A-dECM具有高度有序的超微结构。为了提高生物相容性，通过尺寸排阻色谱法（SEC）去除了A-dECM中潜在的细胞毒性~40 kDa蛋白组分，分级后的A-dECM促进了HaCaT角质形成细胞的增殖。在小鼠烧伤模型中，与小鼠dECM（M-dECM）和PBS对照组相比，A-dECM显著增强了再上皮化、真皮重塑和胶原蛋白有序排列。此外，A-dECM降低了纤维化标志物（α-SMA, TXNDC5）的表达，抑制了炎性细胞因子（IL-1β, TNF-α），并抑制了M1型巨噬细胞极化。这些分子变化与关键皮肤特征的改善恢复相关，包括表皮钉突的形成和部分毛囊的再生。这项工作证明，脱细胞的蝾螈ECM可以指导哺乳动物组织再生，凸显了其作为一种进化启发的、具有临床转化潜力的生物材料。

1. 引言

人类伤口愈合常常以纤维化瘢痕形成为结局，带来显著的功能和心理社会后果。尽管采用了无张力缝合、硅胶敷料和点阵激光等技术，尚无现有疗法能可靠地恢复成人正常的皮肤结构。虽然无瘢痕再生在成年哺乳动物中难以实现，但胎儿皮肤伤口愈合后仅有最小或不可见的疤痕，这种能力归因于其独特的伤口微环境，其特征是炎症减轻、透明质酸水平升高、纤连蛋白快速沉积以及独特的ECM组成。胎儿哺乳动物在愈合过程中表现出最少的免疫细胞浸润和促炎细胞因子表达降低。这种再生能力在妊娠晚期随着免疫系统成熟和纤维化信号通路开始占据主导而逐渐丧失。胎儿伤口ECM显示出相对于其天然抑制剂——金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）更高的基质金属蛋白酶（MMPs）水平，导致高MMP/TIMP比率，这有助于控制基质重塑并防止过度瘢痕组织积累。此外，胎儿成纤维细胞表现出对肌成纤维细胞分化的抵抗，这一过程是伤口收缩和瘢痕形成的核心。

某些物种的无瘢痕愈合表明纤维化并非损伤的必然结果。这些再生模型展示的伤口微环境与成年哺乳动物有根本不同。例如，成年非洲刺毛鼠（Acomys cahirinus）能够再生大面积皮肤伤口，且纤维化最小并恢复真皮附属器。墨西哥蝾螈（Ambystoma mexicanum）展现了最显著的成年再生愈合例子，能够愈合全层皮肤伤口并再生肢体而无纤维化瘢痕。蝾螈在损伤后表现出有限的中性粒细胞和巨噬细胞浸润，这种温和的炎症阶段支持组织保存和再生性重塑。相比之下，成年哺乳动物伤口通常引发强烈的免疫反应。

ECM不仅被视为结构支架，也越来越被认识到是调节组织修复过程中细胞反应的动态微环境。在再生的蝾螈皮肤中，表达的ECM成分如腱生蛋白C、核心蛋白聚糖和特定的胶原蛋白亚型，与组织模式化和抑制肌成纤维细胞活化有关。两栖动物ECM还富含硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和糖胺聚糖（GAGs），它们调节对形态发生重要的生长因子可用性和细胞行为。这些线索，加上一个允许的免疫环境，创造了一个有利于增强组织组织和减少纤维化瘢痕的再生生态位。

天然组织ECM已被证明可以调节免疫细胞的募集和极化，从而调节炎症反应和纤维化进程。巨噬细胞尤其对ECM硬度和组成有反应，这影响其向促炎（M1）或促再生（M2）表型极化。除了免疫细胞，ECM还与成纤维细胞相互作用，通过整合机械线索和生化信号（如TGF-β和整合素介导的信号）调节其向肌成纤维细胞的分化。

脱细胞ECM（dECM）生物材料旨在通过保留基质结构同时消除免疫原性细胞成分来重现关键的再生线索。临床上，源自人类或动物组织的dECM产品，如人工真皮和猪小肠粘膜下层，在烧伤和慢性伤口中已显示出改善的愈合效果。然而，这些基质通常来源于形成疤痕的成年组织，可能缺乏最佳组织再生所需的关键促再生线索。因此，迫切需要识别具有内在无瘢痕愈合特性的替代ECM来源，作为下一代再生生物材料，能够促进再上皮化、支持有序胶原沉积并抑制肌成纤维细胞活化，从而部分重现胎儿再生愈合的特征。

除了dECM，最近还探索了多种基于生物材料的方法用于无瘢痕或减瘢伤口管理，包括免疫调节和机械调节水凝胶、机械调谐支架和试图重建再生微环境的生物活性复合材料。尽管这些方法看起来很有前景，但它们通常需要合成修饰或外源性因子递送。这凸显了探索源自具有内在无瘢痕再生能力物种（如蝾螈皮肤ECM（A-dECM））作为再生线索替代来源的基本原理。

本研究探讨了A-dECM作为减轻纤维化和支持哺乳动物再生伤口愈合的生物活性支架的治疗潜力。我们开发并优化了一种脱细胞方案，能有效去除细胞成分，同时保留A-dECM的超微结构和生化完整性。通过尺寸排阻色谱法（SEC）去除了粗A-dECM中潜在有害的低分子量蛋白组分，产生了具有改善生物相容性的纯化A-dECM产品。使用小鼠烧伤模型，我们评估了A-dECM与小鼠皮肤dECM（M-dECM）相比的再生功效。

2. 材料与方法

2.1. 分离与脱细胞过程

动物皮肤组织收集程序经国立台湾大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。从6-10周龄雄性C57BL/6小鼠手术采集全层背部皮肤组织，同时从3岁雄性墨西哥蝾螈采集全层尾部侧皮。皮肤样本立即冷冻并储存于-80°C。部分样本随后冻干用作下游检测的未处理对照，其余组织进行脱细胞处理。

冻干皮肤的脱细胞按照先前描述的方法进行，略有修改。再水化组织在0.25%胰蛋白酶-EDTA中于室温孵育12小时，然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤三次。样本然后用1% Triton X-100处理12小时，再次洗涤，随后用500 U/ml DNase I孵育24小时。所有步骤在4°C轨道摇床上进行，并添加1%抗生素-抗真菌溶液以防止微生物污染。所得dECM样本使用无菌移液器收集。脱细胞后，dECM样本冻干并储存于-80°C备用。

2.2. 脱细胞验证

2.2.1. 生化分析

使用每种样本约10 mg的冻干皮肤和皮肤dECM进行生化表征。所有测量均归一化至干重。对于胶原蛋白定量，样本在木瓜蛋白酶消化缓冲液中于65°C消化过夜，然后使用Sircol?胶原检测试剂盒测量总可溶性胶原蛋白含量。对于糖胺聚糖（GAG）定量，样本溶解在乙酸钠-柠檬酸缓冲液中，使用Blyscan? GAG检测试剂盒测量GAG含量。对于DNA定量，使用DNeasy Blood & Tissue Kit提取基因组DNA，使用NanoDrop分光光度计测量DNA浓度和纯度。

2.2.2. dECM的扫描电子显微镜分析

冻干dECM样本在蒸馏水中再水化，并进行梯度乙醇脱水系列。脱水样本使用碳导电胶带安装在铝桩上，并使用溅射镀膜机镀覆5 nm厚金层。图像使用扫描电子显微镜在二次电子成像模式下获得。

2.2.3. 皮肤dECM溶解

脱细胞皮肤用蒸馏水彻底冲洗以去除任何残留去污剂。清洁的组织然后冻干并在猪胃蛋白酶溶液中完全消化。通过逐渐添加NaOH中和酸性dECM溶液并不可逆地灭活胃蛋白酶。中和的dECM溶液随后通过细胞滤网过滤以去除残留组织碎片和不溶性杂质。使用超滤离心管进行进一步纯化以实现脱盐和浓缩。最终溶解的dECM分装并储存于-80°C直至使用。

2.2.4. A-dECM分级分离的尺寸排阻色谱法

使用填充Sephacryl S-300凝胶基质的色谱柱进行SEC。柱用缓冲液平衡。溶解的A-dECM小心上样到柱上，使用缓冲液以恒定流速洗脱，并按洗脱时间顺序收集组分。使用BCA蛋白检测试剂盒定量收集组分中的蛋白浓度。选择蛋白浓度最高的组分用于后续处理。

2.3. HaCaT角质形成细胞培养与增殖实验

HaCaT角质形成细胞培养于补充有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM中，并在37°C、5% CO₂的湿润气氛中维持。对于涉及溶解dECM的体外实验，HaCaT细胞首先在完全DMEM中接种24小时，随后在无血清DMEM中过夜血清饥饿。将源自蝾螈或小鼠皮肤的溶解dECM或胶原蛋白I以最终浓度添加到无血清培养基中。

为了评估增殖反应，将HaCaT细胞接种到96孔板中，并在补充dECM的培养基中培养长达7天。使用Alamar Blue实验评估细胞增殖。简而言之，将Alamar Blue试剂添加到每个孔中并在37°C孵育2小时。使用酶标仪测量荧光。

2.4. 体内烧伤伤口模型

小鼠烧伤伤口模型的所有程序经国立台湾大学医学院IACUC批准。6-8周龄雄性C57BL/6小鼠用异氟烷麻醉，背部皮肤剃毛、脱毛并使用商业脱毛膏清洁。使用电子烫伤设备在背中线以外区域诱导双侧全层热损伤。将预加热至100°C的圆柱形金属棒应用于皮肤表面8秒以创建标准化深部真皮烧伤。烧伤诱导后立即用消毒溶液轻轻清洁伤口，并将小鼠随机分配到三个治疗组。每个伤口在烧伤部位正下方接受单次皮内/皮下注射。使用胰岛素注射器进行注射，并缓慢注射数秒以最小化组织损伤。从烧伤后第0天到第4天，每天进行一次治疗。

为了维持湿润的伤口环境，伤口最初用半封闭敷料覆盖。由于每日注射需要移除敷料，敷料在前5天每次注射时更换，之后每2天更换一次直至第14天。烧伤诱导后提供术后镇痛。

通过标准化数码摄影监测伤口愈合进程。使用ImageJ软件量化伤口面积，并计算相对于第0天伤口面积的残留伤口面积百分比。此外，由四名盲法研究人员根据伤口变色和结痂形成对第7、14和21天的伤口愈合进行半定量评分。

2.5. 伤口组织的组织形态计量学分析

将蝾螈/小鼠皮肤ECM和dECM样本以及小鼠烧伤伤口皮肤样本在4%多聚甲醛中固定过夜，脱水并包埋在石蜡中。石蜡块切片为6 μm厚切片用于组织学分析。对于皮肤ECM和dECM样本，切片进行H&E和DAPI染色以观察一般形态和核含量。对于小鼠皮肤组织，制备垂直于前后轴和伤口表面的连续切片。切片进行H&E和马松三色（MT）染色。选择靠近伤口中心的区域用于肉芽组织和纤维化区域的定量分析。在H&E染色切片中通过测量伤口边缘两个上皮舌之间的距离（上皮间隙）相对于原始伤口宽度来量化再上皮化，并使用公式表示为闭合百分比。

2.6. 免疫组织化学和免疫荧光染色

对于免疫组织化学和免疫荧光染色，小鼠伤口组织切片首先脱蜡并使用Tris-EDTA缓冲液进行抗原修复。冷却至室温后，用PBS洗涤切片三次。

对于免疫组织化学染色，载玻片用过氧化物酶封闭试剂处理10分钟，随后用蛋白封闭溶液孵育30分钟。切片然后在4°C与一抗孵育过夜。第二天，载玻片洗涤并依次孵育。使用稀释的DAB底物进行显色发育。最后，载玻片用苏木精复染15秒，并用蒸馏水冲洗三次。

对于免疫荧光染色，抗原修复和PBS洗涤后，切片用4%多聚甲醛固定10分钟，并用3%牛血清白蛋白封闭1.5小时。样品然后在4°C与一抗孵育过夜。洗涤后，切片在室温下与Alexa Fluor标记的二抗孵育1小时。细胞核用DAPI复染。载玻片再次洗涤并使用封片剂封片。

使用成像系统获取免疫组织化学和免疫荧光图像。使用ImageJ软件分析图像。

2.7. 真皮成纤维细胞培养

成人真皮成纤维细胞（HDFs）培养在成纤维细胞培养基中，补充有2% FBS、1%成纤维细胞生长补充剂和1%青霉素-链霉素溶液。细胞在37°C、5% CO₂和95%空气的湿润培养箱中维持。为了诱导成纤维细胞中的TGF-β1刺激，HDFs在无血清培养基中培养，并在下游实验前用TGF-β1处理48小时。

2.8. 实时定量聚合酶链反应

使用试剂盒从烧伤后第14天和第28天收获的小鼠伤口组织中提取总mRNA。使用逆转录试剂盒从提取的RNA合成cDNA。使用SYBR Green Supermix进行定量实时PCR（qPCR）。使用软件对小鼠来源的cDNA模板进行基因表达定量。

2.9. 蛋白质印迹分析

从不同组的伤口组织中分离总蛋白。组织在RIPA缓冲液中匀浆，补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物。使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。等量蛋白在10% SDS-PAGE凝胶上分离，并转移到PVDF膜上。膜使用封闭缓冲液封闭，并在4°C与一抗孵育过夜。随后，膜与HRP标记的二抗孵育。使用ECL试剂显示蛋白条带，并使用成像系统成像。使用ImageJ软件量化条带强度。

2.10. 巨噬细胞极化实验

人单核细胞系THP-1培养于RPMI 1640培养基中，补充有10% FBS和1%青霉素-链霉素。细胞在37°C、5% CO₂的湿润培养箱中维持。每三到五天，通过离心传代细胞，并以密度重悬于新鲜培养基中。对于巨噬细胞分化，THP-1单核细胞接种并用佛波酯（PMA）处理24小时以诱导M0巨噬细胞极化。通过用干扰素-γ（IFN-γ）和脂多糖（LPS）刺激M0巨噬细胞48小时产生M1巨噬细胞。为了研究dECM的免疫调节作用，用M-dECM或A-dECM处理M0巨噬细胞，随后分析巨噬细胞表型分布。此外，为了评估A-dECM是否可以逆转M1极化并促进向M2表型转变，在48小时M1诱导期间与IFN-γ和LPS共同施用A-dECM。

使用ELISA试剂盒测量巨噬细胞培养上清液中的炎性细胞因子水平。将THP-1来源的巨噬细胞培养至约90%汇合度，然后在M-dECM或A-dECM存在下用LPS刺激48小时。刺激后，收集培养培养基并分析肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平。

为了评估巨噬细胞极化，通过流式细胞术评估与M1和M2表型相关的表面标志物。简而言之，收获细胞并用冷PBS洗涤两次。对于PMA诱导的贴壁巨噬细胞，使用细胞刮刀分离，然后重悬于染色缓冲液中。对于表面染色，细胞在4°C黑暗中分别与荧光染料标记的单克隆抗体孵育30分钟。每个标志物在单染样品中分析。染色后，细胞用染色缓冲液洗涤两次，并重悬于缓冲液中用于流式细胞术采集。使用流式细胞仪获取荧光数据。使用未染色细胞对照来设门阈值并消除非特异性结合。

2.11. 统计分析

所有定量数据表示为平均值±标准差（S.D.）。使用GraphPad Prism 9进行统计分析。使用单因素方差分析（ANOVA），然后进行Tukey事后多重比较检验进行组间比较。在所有图中，统计学显著性一致由星号表示。没有注释的比较没有统计学意义。

3. 结果

3.1. 脱细胞去除细胞并保留皮肤ECM

通过组织学染色和DNA定量验证了皮肤组织脱细胞的有效性。H&E染色和DAPI染色显示蝾螈和小鼠皮肤组织中细胞核几乎完全去除。定量分析显示，蝾螈组织中的DNA含量从脱细胞前的89.3 ± 20.0 μg/mg显著降低到脱细胞后的0.4 ± 0.2 μg/mg，小鼠组织则从37.6 ± 7.2 μg/mg降低到5.2 ± 1.6 μg/mg。主要的ECM成分在脱细胞后得以保留。蝾螈的胶原蛋白水平在天然皮肤和dECM中分别为18.9 ± 2.3 μg/mg和21.7 ± 4.6 μg/mg，小鼠则为8.2 ± 2.2 μg/mg和8.4 ± 2.4 μg/mg，天然组织和脱细胞组织之间无显著差异。类似地，GAG含量保持不变：蝾螈为2.5 ± 0.3 vs. 2.6 ± 0.4 μg/mg，小鼠为0.8 ± 0.0 vs. 0.8 ± 0.1 μg/mg。种间比较显示，蝾螈组织具有比小鼠组织更高的DNA、胶原蛋白和GAGs基线水平。SDS-PAGE分析显示，在两种物种的天然皮肤样本中，约40 kDa处存在一个蛋白条带，该条带在脱细胞后显著减少。在15-40 kDa范围内，A-dECM和M-dECM显示出不同的蛋白谱。扫描电子显微镜（SEM）显示了种间超微结构差异：M-dECM呈现致密、无序的纤维网络，而A-dECM显示出高度排列和编织的结构。

3.2. 分级A-dECM的表征

为了确定A-dECM用于体外应用的最佳浓度，使用浓度递增的溶解A-dECM进行了剂量反应实验。A-dECM在较低浓度下促进HaCaT增殖，但在50 μg/ml时导致增殖指数降低。为了检查特定组分是否与这种浓度依赖性反应相关，对溶解的A-dECM进行尺寸排阻色谱法（SEC）以按分子量分离蛋白组分。M-dECM经过相同的脱细胞和溶解程序，但作为未分级对照使用。

收集单个SEC组分，使用BCA法定量，脱盐并重悬于PBS中。选择蛋白浓度超过1000 μg/ml的组分，浓缩并在HaCaT增殖实验中测试。将HaCaT细胞在低血清培养基中培养，并补充不同浓度的单个组分。在0.05 μg/ml时，第41号组分的增殖指数低于其他组分。在0.5 μg/ml时未观察到显著差异。在5 μg/ml时，第40号组分显示出最低的增殖指数。在50 μg/ml时，未分级A-dECM和第40号组分均导致增殖显著降低，而第41号组分显示适度下降。相比之下，第42-49号组分维持的增殖指数大于1。

将增殖指数接近或高于1的组分视为相对无抑制性，并合并成两组（第40-41号和第42-49号）进行重新定量和额外测试。在0.05 μg/ml时，未分级A-dECM显示出比第40-41号组分更高的增殖指数。在0.5 μg/ml时，M-dECM显示出比第40-41号组分更高的值。在5 μg/ml时，A-dECM显示出比M-dECM和两个合并组分（第40-41号和第42-49号）更高的增殖指数。在50 μg/ml时，未分级A-dECM和第40-41号组分的增殖指数降至接近0，而M-dECM和第42-49号组分仍接近1。单个组分的SDS-PAGE显示第40-41号组分在约40 kDa处有显著的蛋白条带，而第42-49号组分显示出不同的条带模式。对于后续测试，使用合并的第42-49号组分，并排除第40-41号组分。

3.3. 局部应用A-dECM增强小鼠烧伤伤口愈合

在小鼠深部真皮烧伤损伤模型中，从热损伤后第0天到第4天，每天在伤口床局部注射PBS、M-dECM或A-dECM。治疗时间线和采样计划如图所示。代表性伤口图像显示了不同治疗组的宏观愈合过程。到第14天，A-dECM治疗的伤口收缩至原始面积的33.2 ± 6.3%，而PBS组为65.4 ± 7.1%，M-dECM组为62.3 ± 6.8%。

关于伤口评分数据，A-dECM治疗的伤口在第7天表现出稍深的色素沉着和较厚的结痂，结痂硬度评分为2.3 ± 0.5，高于PBS（1.5 ± 0.5）和M-dECM（1.3 ± 0.5）。在第14天，各组之间在硬度或颜色评分上没有显著差异。在第21天，A-dECM治疗的伤口表现出减少的结痂/硬度（1.4 ± 0.5），而PBS组为2.7 ± 0.5，M-dECM组为2.4 ± 1.1。变色评分在A-dECM组（1.4 ± 0.5）也显著低于PBS（3.0 ± 0.8）或M-dECM（2.1 ± 1.2）组。

3.4. A-dECM治疗伤口中表皮分层和真皮结构的恢复

在第2、7和14天，H&E染色揭示了上皮覆盖度和真皮完整性的动态变化。在第2天，所有组在伤口中心都表现出表皮的部分丢失或碎裂，伴有密集的炎症细胞浸润和显著的底层真皮结构破坏。残留的表皮在伤口边缘仍然可见。到第7天，所有组的伤口床仍未完全再上皮化。在M-dECM和A-dECM组中，观察到从伤口边缘延伸的上皮舌，表明部分启动了再上皮化。烧伤区内的毛囊出现萎缩，尤其是在PBS组中。在PBS处理的组织中，表皮层通常不连续或碎裂，提示覆盖延迟或组织不稳定。在第14天，A-dECM组在伤口中心显示出延伸但未完全的新上皮化覆盖。部分伤口表面仍被轻度嗜酸性结构占据，可能代表不完全脱落的焦痂或纤维蛋白物质，而非新形成的表皮。在PBS组中，厚厚的结痂覆盖了大部分伤口床，表明再上皮化延迟。M-dECM组显示出厚度不等的部分上皮覆盖。一致地，第14天再上皮化的定量分析表明，A-dECM组的上皮闭合（40.9 ± 6.1%）显著高于PBS（32.1 ± 3.7%）和M-dECM（31.4 ± 2.6%）组。

在晚期重塑阶段（第28天），使用马松三色（MT）染色检查胶原沉积和真皮结构。在PBS治疗的伤口中，胶原纤维稀疏且排列紊乱，整个伤口床存在松散结构区域。M-dECM处理的组织显示中等胶原密度和部分排列的纤维。相比之下，A-dECM组显示出致密且排列良好的胶原束，更接近未受伤真皮的架构。定量分析显示，A-dECM组（84.5 ± 8.3 μm）和M-dECM组（79.6 ± 9.1 μm）的表皮厚度显著低于PBS组（123.1 ± 10.2 μm）。皮肤厚度比（受伤组织与相邻正常组织之比）在A-dECM组（31.0 ± 4.2%）和M-dECM组（31.7 ± 3.9%）显著高于PBS组（18.7 ± 2.5%）。通过阳性染色面积百分比量化真皮内的胶原含量。A-dECM治疗的伤口显示胶原密度为68.2 ± 4.5%，而M-dECM组为62.1 ± 5.1%，PBS组为54.3 ± 4.9%。

在第28天，对K5、K10和Loricrin的免疫组织化学染色进一步评估了再生表皮的空间组织。在所有治疗组以及正常皮肤中，K5定位于基底层，K10定位于棘层，Loricrin定位于颗粒层的再生表皮中。这些标志物沿伤口周边以基底到表浅的梯度排列，与恢复的分层结构一致。尽管再上皮化存在早期差异，但到第28天，所有组在伤口边缘都显示出典型的层特异性标志物定位的重新建立。此外，伤口中心垂直标志物厚度的定量分析表明，K5、K10和Loricrin信号分别对应于基底层、棘层和颗粒层。基底层厚度的比较显示，A-dECM组的K5阳性层比PBS和M-dECM组更厚。

除了表皮再生，还检查了血管生成以评估愈合过程中的血管重塑。通过免疫荧光染色在第14天和第28天观察CD31阳性内皮细胞。分布模式在所有实验组中看起来相似。血管密度定量测量显示，在任一时间点，PBS、M-dECM和A-dECM处理之间没有统计学显著差异。

3.5. A-dECM治疗烧伤伤口中纤维化标志物表达降低

使用免疫荧光染色分析烧伤后第14天和第28天纤维化标志物TXNDC5和α-SMA的表达。在第14天，A-dECM治疗伤口中的TXNDC5信号强度为134.1 ± 70.2 AU，低于PBS（242.7 ± 118.8 AU）和M-dECM（156.3 ± 88.9 AU）组。在第28天，A-dECM组的TXNDC5强度进一步下降至82.5 ± 46.5 AU，而PBS和M-dECM组分别为191.9 ± 103.8和106.6 ± 51.4 AU。α-SMA表达也观察到类似趋势