激发子处理与收获时间对Satureja khuzistanica细胞悬浮培养中迷迭香酸合成的调控机制研究

《In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant》：Effects of elicitor treatments and harvesting times on rosmarinic acid production in cell suspension culture of Satureja khuzistanica

本研究针对药用植物Satureja khuzistanica细胞悬浮培养中迷迭香酸(RA)产量低的问题，系统探讨了甲基茉莉酸(MeJ)、水杨酸(SA)、硫酸氧钒(Van)、酵母提取物(YE)和冠菌素(Cor)等五种激发子在不同处理时间和收获时间对RA生物合成的影响。研究发现0.074 mM Van和0.05 mM MeJ处理可使RA产量分别达到3294.23 mg·L-1和3036.04 mg·L-1，且激发子接种后11天处理、48-72小时收获为最佳工艺参数。该研究为植物细胞培养规模化生产RA提供了重要技术参考。

　　

在自然界中，植物通过产生丰富的次级代谢产物来应对生物和非生物胁迫，这些具有生物活性的化合物不仅是维护人类健康的重要药物来源，还被广泛应用于化妆品、食品和染料工业。然而，许多药用植物仍依赖野生采集，过度采收和生境破坏导致资源日益枯竭。植物细胞培养技术为可持续生产这些高价值化合物提供了新途径，但培养系统中次级代谢产物产量低仍是制约其产业化应用的关键瓶颈。

针对这一挑战，研究人员将目光投向激发子技术——通过添加特定化学信号分子刺激植物细胞防御反应，从而激活次级代谢途径。迷迭香酸(RA)作为一种具有抗炎、抗氧化、抗病毒和神经保护活性的苯丙素类化合物，在药用植物Satureja khuzistanica中显示出卓越的生物合成潜力。尽管前期研究已建立该植物的细胞悬浮培养体系，但如何通过优化激发子处理策略最大化RA产量仍需深入探索。

本研究创新性地将处理时间点和收获时间点同时纳入优化体系，系统评估了五种激发子（甲基茉莉酸MeJ、水杨酸SA、硫酸氧钒Van、酵母提取物YE和冠菌素Cor）在不同浓度、不同处理时间及不同收获时间对RA生物合成的调控规律。研究旨在揭示时间因素在激发子诱导效应中的关键作用，为开发高效的RA生产工艺提供理论依据。

关键技术方法包括：建立S. khuzistanica细胞悬浮培养体系，采用不同浓度激发子分别在培养第3天和第11天进行处理，设置6小时至264小时多个收获时间点，通过HPLC定量分析RA含量，采用统计学方法评估各因素对RA产量的影响。

确定细胞收获的最佳时间

细胞生物量积累显示，所有处理组（包括对照组）的鲜重和干重均在培养第11天达到峰值。然而，激发子处理均导致生物量产量降低，对照组在第11天获得最高生物量（鲜重213.5 g·L^-1，干重20.130 g·L^-1）。RA生物合成趋势与对照组明显不同，所有处理组RA水平均在处理后48小时达到最高浓度。其中0.05 mM MeJ处理获得最高RA生物合成（259.03 mg·g^-1 DW），显著高于对照组（165.83 mg·g^-1 DW）。48小时后，激发子处理组RA含量下降，而对照组RA含量从72小时开始逐渐增加。

确定不同激发子处理的最佳时间

分析显示S. khuzistanica细胞悬浮培养中RA产量在激发子处理后48小时达到最大。为进一步优化，研究设置了两个处理时间点（培养第3天和第11天）。初期处理（0.1-0.2 mM MeJ、1-2 mM Cor、0.074-0.30 mM Van）在第3天进行，3天后收获细胞。结果显示所有MeJ和Cor处理浓度均显著降低细胞鲜重和干重，而Van处理对鲜重无显著影响，但各浓度均降低干重。0.1 mM MeJ处理获得最高RA生物合成（177.86 mg·g^-1 DW），是对照组的1.45倍。0.1 mM MeJ和0.074 mM Van处理获得最高RA产量（分别为1092.54 mg·L^-1和1081.43 mg·L^-1）。

基于初步试验，研究设计了补充实验，在培养第11天施加激发子处理（0.05-0.2 mM MeJ、1 mM Cor、0.074-0.3 mM Van、1 mg·L^-1 YE），48小时后收获。结果显示1 mM Cor处理获得最低细胞生物量（鲜重169.25 g·L^-1，干重13.38 g·L^-1），而0.074 mM Van处理获得最高生物量（鲜重280.75 g·L^-1，干重18.92 g·L^-1）。所有MeJ浓度和0.074 mM Van均增强RA生物合成，其中0.1 mM MeJ处理获得最高RA产量（186.99 mg·g^-1 DW），是对照组的3.11倍。RA产量在0.074 mM Van处理中达到最高（3294.23 mg·L^-1），0.05 mM MeJ和1.0 mg·L^-1 YE处理也显著提高RA产量。

水杨酸处理对细胞悬浮培养的影响

SA处理（0.02-0.1-1.0 mM）在培养第3天和第11天进行，处理后48小时和72小时收获。结果显示细胞鲜重和干重均随SA浓度增加而降低。培养第11天处理的细胞干物质分配率显著高于第3天处理。RA生物合成能力显示时间依赖性，第11天处理的细胞RA产量显著高于第3天处理。在两个处理时间点，72小时收获的细胞RA积累均高于48小时收获。0.1 mM SA在第11天处理、72小时收获获得最高RA生物合成（187.38 mg·g^-1 DW）和最高RA产量（2395.76 mg·L^-1）。

研究结果表明，MeJ、SA、Van和YE均能促进RA的生物合成和产量，而Cor是唯一对RA产生有抑制作用的激发子。除了激发子浓度外，处理时间和培养时间对激发过程至关重要。培养第11天施加激发子可获得最高RA积累，处理后48-72小时（根据激发子类型）收获细胞为最佳收获时间。特别值得注意的是，0.074 mM Van处理虽然RA生物合成能力低于0.1 mM MeJ，但由于其对细胞生长的积极影响，最终获得了更高的RA产量。

该研究首次系统揭示了时间因素在S. khuzistanica细胞悬浮培养RA生产中的关键作用，证实了Van作为一种高效激发子的潜力。研究发现RA生物合成能力与生物量积累呈负相关，表明初级代谢与次级代谢之间存在权衡关系。这一发现为优化植物细胞培养生产有价值代谢物提供了重要启示：激发子应在细胞充分建立后添加，而非培养初期；由于激发子对植物细胞系统的毒性作用，其在悬浮培养中与细胞接触时间不应超过72小时。

研究成果为规模化生产RA提供了可靠的技术参数，展示了植物细胞培养技术作为可持续生产高价值药用化合物的应用前景。通过精确控制激发子处理时间和收获时间，可显著提高目标代谢物产量，降低生产成本，为药用植物资源保护与可持续利用提供了创新解决方案。