猪血小板裂解物替代胎牛血清的系统评估：促进细胞增殖、维持分化潜能与确保免疫表型稳定性

《Stem Cell Research & Therapy》：Systematic evaluation of porcine platelet lysate as a fetal bovine serum substitute: enhancing cell proliferation, maintaining differentiation potential, and ensuring immunophenotypic stability

本研究针对胎牛血清(FBS)在细胞培养中存在的成分复杂、批次差异大及潜在病原体污染等问题，系统评估了猪血小板裂解物(pPL)作为其替代品的潜力。通过细胞计数、LDH细胞毒性检测、流式细胞术及多向分化实验，发现pPL能显著促进A375和HDF细胞增殖，维持间充质干细胞(MSCs)免疫表型稳定性(CD73+/CD90+>95%，CD34-<2%)，并在成骨分化方面表现优异。该研究为开发安全、稳定的FBS替代品提供了新策略，对细胞治疗和再生医学具有重要意义。

　　

在细胞治疗和再生医学快速发展的今天，间充质干细胞(MSCs)技术作为核心推动力，展现出巨大的应用潜力。然而，传统的细胞培养系统严重依赖胎牛血清(FBS)，其成分复杂、批次差异大，且存在病原体污染风险，这些问题严重制约了细胞治疗的标准化和临床应用。面对FBS的局限性，开发稳定、安全且经济的血清替代品成为细胞产业可持续发展的关键。

近年来，研究人员探索了多种FBS替代方案，包括化学成分确定的培养基、植物/酵母水解物、重组人源蛋白复合物以及血小板来源的产品。其中，血小板裂解物(PL)因其富含多种生长因子而备受关注。猪血小板裂解物(pPL)由于原料易得且与人生长因子有85%的同源性，成为一种新兴的替代品。然而，pPL在实际应用中的标准化问题以及其对细胞分化调控的具体机制尚不明确。

为此，研究人员在《Stem Cell Research & Therapy》上发表了最新研究成果，系统评估了pPL替代FBS的潜力。研究团队通过冻融法制备pPL，并对其质量进行了严格控制。随后，他们培养了三类细胞：肿瘤细胞(A375)、成人细胞(HDF)和干细胞(hucMSCs)，从细胞增殖、细胞毒性、免疫表型和多向分化能力等方面全面比较了pPL与FBS的差异。

研究采用的关键技术方法包括：通过冻融法制备pPL并进行质量控（检测PDGF-AA、-AB、-BB浓度及总蛋白浓度）；使用细胞计数和LDH细胞毒性检测评估细胞增殖和活力；利用流式细胞术分析hucMSCs表面标志物（CD73、CD90、CD34）的表达以评估免疫表型稳定性；通过组织化学染色（油红O、阿尔新蓝、茜素红）和qRT-PCR技术检测hucMSCs向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化的能力；所有统计均使用GraphPad Prism 8进行。

pPL对体外培养细胞增殖的有益作用

研究发现，pPL能显著促进A375和HDF细胞的增殖。在10天的观察期内，pPL处理组的细胞形态稳定，而FBS组细胞则出现明显肥大。细胞计数显示，无论是A375细胞还是HDF细胞，在10% pPL培养基中的增殖数量均显著高于10% FBS组。LDH释放检测进一步证实，pPL组的LDH释放量始终维持在较低水平，表明pPL引起的细胞损伤更小，生物相容性更好。

pPL对HucMSCs表面免疫表型的影响

为了评估pPL对hucMSCs免疫表型稳定性的影响，研究人员通过流式细胞术检测了关键表面标志物的表达。结果表明，在5% pPL、10% pPL和10% FBS条件下培养两周后，hucMSCs均高表达CD73和CD90（阳性率>95%），而低表达CD34（阳性率<2%），完全符合国际细胞治疗学会(ISCT)的标准。这表明pPL不仅能支持hucMSCs的体外扩增，还能很好地维持其免疫表型特征，这对于保持MSCs的治疗潜力（如免疫调节功能和归巢能力）至关重要。

pPL对HucMSCs多向分化潜能的影响

研究人员进一步评估了pPL对hucMSCs多向分化能力的影响。通过脂肪生成、成骨生成和软骨生成诱导实验，结合组织化学染色和qPCR分析，发现pPL在成骨分化方面表现出显著优势。茜素红染色显示，pPL组钙结节形成面积显著大于FBS组，且成骨标志基因OPN和ALP的表达也更高。在软骨分化方面，pPL组与FBS组的能力相似。而在脂肪分化方面，pPL组的脂质积累略低于FBS组，但仍处于正常分化范围。

研究结论与讨论部分强调，pPL作为一种功能性的FBS替代品，在支持MSCs培养和分化方面表现出色。它不仅能够维持MSCs的表型稳定性，还具有“增殖优先、分化可控”的独特优势。pPL中丰富的生长因子（如PDGF、FGF-2、TGF-β等）通过激活PI3K/AKT/mTOR、MAPK等关键信号通路，协同促进细胞增殖，并通过复杂的网络调控细胞分化。例如，TGF-β家族成员通过Smad信号通路调控多向分化：TGF-β1通过Smad2/3/4复合物上调RUNX2表达促进成骨分化，而TGF-β3则通过Smad1/5通路驱动软骨形成。BMP-2/6异源二聚体通过激活ALK3受体，触发SMAD1/5/8和p38 MAPK通路，上调成骨标志物Runx2和Osterix，促进钙化结节形成。

该研究的创新点在于系统验证了pPL作为多功能FBS替代品的广泛应用性，明确了其对MSCs免疫表型稳定性的维持作用，并揭示了其在成骨分化方面的“优势效应”，为再生医学中的定向分化提供了新策略。尽管pPL在生产工艺、免疫原性和猪内源性逆转录病毒(PERV)污染风险等方面仍存在挑战，但通过优化制备流程、深入分析生长因子作用机制以及严格评估生物安全性，pPL有望在细胞培养系统和再生医学中得到更广泛的应用。