通过活细胞单细胞成像揭示癌症干细胞生态位的空间自组织机制

《Stem Cell Research & Therapy》：Spatial self-organization of cancer stem cell niches revealed by live single-cell imaging

本研究针对肿瘤异质性与治疗抵抗中的表型可塑性难题，通过构建pALDH1A1:mNeptune荧光报告系统，结合超宽场显微成像技术，首次实现了乳腺癌细胞中干细胞生态位的动态可视化。研究发现癌症干细胞（CSC）会自发形成空间聚集的生态位，其维持依赖于细胞周期相关的表型遗传和细胞间相互作用，为靶向肿瘤干细胞提供了新的理论依据。

　　

在肿瘤治疗的漫长征程中，科学家们逐渐意识到肿瘤并非由均一的细胞组成，而是存在着复杂的异质性。其中，癌症干细胞（CSC）理论近年来备受关注。这类细胞虽然数量稀少，却拥有自我更新和分化能力，被认为是肿瘤发生、发展、转移和治疗抵抗的"罪魁祸首"。然而，CSC并非一成不变，它们具有显著的表型可塑性，能够在干细胞状态和分化状态之间动态转换，这种特性使得针对CSC的治疗策略面临巨大挑战。

传统的肿瘤研究多采用群体水平分析，难以捕捉单个细胞的行为动态。特别是在二维培养条件下，CSC的比例通常很低（1%-5%），这使得在单细胞水平上研究CSC的时空动态变得尤为困难。此外，CSC在肿瘤组织中并非随机分布，而是倾向于形成特定的空间结构——干细胞生态位。这种生态位的形成和维持机制尚不清楚，究竟是细胞自主的表型遗传，还是细胞间相互作用主导了这一过程？这些问题成为理解肿瘤异质性和治疗抵抗的关键。

为了解决这些难题，法国里尔大学的研究团队在《Stem Cell Research & Therapy》上发表了最新研究成果。他们通过活细胞单细胞成像技术，首次揭示了癌症干细胞生态位的空间自组织机制。研究团队选用了两种三阴性乳腺癌细胞系SUM159PT和MDA-MB-231，这些细胞系被稳定转染了pALDH1A1:mNeptune荧光报告系统。ALDH1A1是乳腺癌干细胞的经典标志物，其表达水平可以反映细胞的干细胞特性。

研究团队开发了一套超宽场显微成像系统，能够以45分钟的时间分辨率连续数天追踪数千个单个细胞。该系统通过扫描1024个重叠的高分辨率图像（约222μm×222μm），拼接成约6.8mm×6.8mm的宽视野，从而实现了在单细胞水平上同时获得空间和时间信息的能力。图像处理方面，研究人员首先进行了 shading correction 来校正照明不均匀性，然后基于Hoechst核染色进行细胞分割和追踪，最后提取单个细胞的荧光信号进行分析。

通过分析单个细胞的mNeptune荧光强度分布，研究人员发现SUM159PT细胞的荧光信号呈现明显的三峰分布（图1D）。他们使用复合概率密度函数进行拟合，将细胞分为三个群体：癌症分化细胞（CDC，低荧光）、中间状态癌细胞（iCC，中等荧光）和癌症干细胞（CSC，高荧光）。这种分布模式在MDA-MB-231细胞中也得到验证，表明这种表型分层在不同乳腺癌细胞系中具有普遍性。

点模式分析揭示表型空间分离

研究人员采用点模式分析中的点相关函数（PCF）来量化不同表型细胞的空间分布 pattern。结果显示，CSC表现出强烈的空间自相关，在约15μm距离上其聚集程度是完全空间随机（CSR）的20倍（图2D）。这种聚集 pattern 随着时间推移逐渐扩大，特征长度从实验初期的约50μm增加到4天后的约100μm。相比之下，CDC也显示出聚集趋势，但程度较弱。更重要的是，CSC和CDC之间存在明显的空间互斥，在短距离（约15μm）上，CSC在CDC高密度区域的出现概率比随机预期低10-15倍（图2B）。这种空间 zonation 模式提示CSC倾向于形成特定的生态位结构，与分化细胞在空间上分离。

单细胞时间序列聚类识别表型转换

通过对19620个单细胞时间序列进行无监督聚类分析，研究人员识别出了多种动态表型转换模式（图3B）。约70%的细胞保持稳定的表型（低或高荧光），而约30%的细胞处于过渡状态，其荧光信号在细胞周期内发生显著变化。特别值得注意的是，聚类分析识别出了从CDC向CSC转变的重编程事件（簇#10和#11），这些事件占分析时间序列的4.8%，且不仅限于种群建立的初始阶段，在稳态阶段也持续发生（图3C）。这表明CSC群体的维持依赖于持续的表型转换动态平衡，而非简单的静态维持。

谱系分析揭示表型遗传

通过追踪细胞谱系（图4A），研究人员发现表型在细胞世代间存在明显遗传。母细胞与子代细胞之间的荧光信号具有强相关性（R²=0.70），表明有丝分裂过程中的表型遗传是CSC生态位形成的重要机制。有趣的是，细胞分裂通常伴随着荧光信号的系统性下降（ΔI_dm≈-0.25），这可能反映了有丝分裂期间染色质结构和转录活性的变化。相比之下，细胞周期内的信号变化（ΔI₂₁）分布更广，约30%的细胞至少使其荧光水平翻倍，这与时间序列聚类发现的过渡细胞比例一致。

细胞间通讯调控表型转换

为了区分表型遗传和细胞间相互作用的相对贡献，研究人员进行了空间模拟实验（图5）。结果显示，仅考虑表型遗传的模型虽然能复现种群水平的表型比例动态，但无法完全解释观察到的空间聚类 pattern（图5D,E）。特别是，模拟中的CSC自相关强度（g₊₊）仅为实验值的1/5-1/3，表明存在其他机制促进CSC的空间聚集。

进一步分析发现，细胞局部微环境显著影响表型转换。在高CSC密度区域（f₊>0.9），iCC和CSC的信号增加（重编程）更为频繁；而在低CDC密度区域（f_-<0.1），CDC也表现出向CSC转换的趋势（图6）。这种微环境依赖性表明细胞间通讯（可能是旁分泌或近分泌信号）在维持CSC生态位中发挥关键作用。值得注意的是，这种环境效应主要体现在细胞周期内的表型转换，而有丝分裂期间的表型变化则相对独立于微环境。

这项研究通过创新的活细胞成像技术，首次在单细胞水平揭示了癌症干细胞生态位的自发形成机制。研究表明，CSC的空间自组织是表型遗传和细胞间通讯共同作用的结果：对称分裂通过局部正反馈促进相似表型细胞的聚集，而细胞间信号（可能涉及Notch、Wnt等通路）则提供种群水平的反馈，稳定长程空间结构。这些发现不仅深化了对肿瘤异质性形成机制的理解，也为开发针对CSC生态位的治疗策略提供了新思路。未来研究可以进一步探索参与这一过程的特定信号通路，以及这种自组织模式在三维培养和体内环境中的普适性，为最终实现针对肿瘤干细胞的精准治疗奠定基础。