靶向NOX2-ROS-NLRP3炎症小体轴调控创伤性脑损伤后神经炎症的新策略

《Journal of Neuroinflammation》：The NOX2-ROS-NLRP3 inflammasome axis in traumatic brain injury

本研究针对创伤性脑损伤(TBI)后由吞噬细胞NADPH氧化酶2(NOX2)驱动的慢性神经炎症难题，探讨了小分子NOX2抑制剂GSK2795039通过抑制NOX2-ROS-NLRP3炎症小体轴对TBI后继发性损伤的治疗潜力。研究发现GSK2795039能有效抑制小胶质细胞NOX2活性，降低ROS、硝酸盐及细胞因子水平，减少浸润髓系细胞NOX2/IL-1β表达，改善急性期运动功能，为TBI神经炎症调控提供了新靶点。

　　

当大脑遭受外力冲击时，不仅会立即造成原发性损伤，更会引发一系列复杂的继发性病理过程，其中神经炎症是导致神经细胞进行性死亡和长期神经功能障碍的关键因素。在创伤性脑损伤（TBI）后的慢性阶段，大脑内的免疫细胞——特别是小胶质细胞和浸润的髓系细胞——会持续处于过度激活状态，释放大量炎症因子和活性氧（ROS），形成有害的微环境，阻碍神经修复。吞噬细胞NADPH氧化酶2（NOX2）是产生ROS的关键酶复合物，其慢性激活被认为是维持这种病态炎症的核心环节。同时，NOX2衍生的ROS还能作为“启动信号”激活Nod样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体，进而促使促炎因子IL-1β和IL-18的成熟与释放，加剧脑损伤。尽管临床前研究证实抑制NOX2或NLRP3具有神经保护潜力，但如何精准靶向这一轴心通路，并阐明其在不同免疫细胞中的作用，仍是亟待解决的问题。

在此背景下，由Janeen Laabei等人在《Journal of Neuroinflammation》上发表的研究，聚焦于NOX2-ROS-NLRP3这一炎症轴。研究人员假设，利用一种能穿透血脑屏障的小分子NOX2抑制剂GSK2795039，可以上游抑制该通路，从而减轻TBI后的神经炎症并改善功能预后。为了验证这一设想，他们开展了一系列从体外到体内的综合性实验。

研究者主要运用了以下几类关键技术方法：在体外，采用脂多糖（LPS）和尼日利亚菌素（nigericin）刺激永生化小胶质细胞（IMG）和原代小胶质细胞，模拟炎症激活状态；通过蛋白质免疫印迹（Western blot）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和流式细胞术检测NOX2活性、ROS水平、NLRP3炎症小体组分及细胞因子。在体内，使用成年雄性C57BL/6J小鼠建立可控皮质撞击（CCI）TBI模型；通过液相色谱-质谱联用（LC/MS）进行药物动力学分析；利用多色流式细胞术精细解析损伤大脑中不同免疫细胞（小胶质细胞、中性粒细胞、单核细胞、T细胞）的炎症表型；并通过行为学测试（转棒实验、Y迷宫、新物体识别等）和组织学分析（损伤体积测定）评估神经功能恢复与神经病理变化。

GSK2795039抑制促炎小胶质细胞的NOX2活性及下游炎症信号

研究人员首先在体外验证GSK2795039的功效。LPS/nigericin（L/N）刺激能显著提升IMG细胞中NOX2的平均荧光强度（MFI）及其活性，同时增加ROS、硝酸盐和肿瘤坏死因子α（TNFα）的水平。GSK2795039预处理能以浓度依赖的方式有效抑制这些指标。值得注意的是，特异性NLRP3抑制剂MCC950虽然能降低ROS，但对NOX2蛋白表达、硝酸盐和TNFα无影响，这表明GSK2795039的作用更上游且广泛。

NOX2抑制减弱小胶质细胞中NLRP3炎症小体的激活

深入探究NOX2-ROS-NLRP3轴发现，L/N刺激增加了细胞裂解液和上清液中NLRP3、裂解的caspase-1、裂解的IL-1β以及ASC（凋亡相关斑点样蛋白）的表达。GSK2795039处理显著降低了上清液中这些蛋白的水平，特别是裂解的caspase-1和IL-1β。同时，ELISA结果证实GSK2795039和MCC950均能抑制IL-1β和IL-18的释放以及细胞焦亡标志物乳酸脱氢酶（LDH）的漏出。这些结果在原代小胶质细胞实验中得到了进一步验证，表明NOX2抑制确实能有效遏制NLRP3炎症小体的活化。

TBI后大脑中NOX2-ROS-NLRP3炎症轴的细胞参与者

将研究转向体内，流式细胞术分析揭示了TBI后大脑免疫景观的动态变化。损伤后第3天（DPI），海马体中NOX2相关基因（Cyba, Cybb）、Nlrp3和微胶质细胞吞噬标记Cd68的mRNA表达达到峰值。细胞数量上，中性粒细胞在1 DPI主导浸润细胞，而炎性单核细胞在3 DPI达到高峰。功能上，小胶质细胞的NOX2/ROS/IL-1β活化在3 DPI最显著并持续至7 DPI；浸润的中性粒细胞和单核细胞则在1 DPI和3 DPI表现出强烈的NOX2/ROS/IL-1β信号。这表明不同免疫细胞在TBI后不同时间点共同推动了NOX2/ROS/NLRP3炎症轴的激活。

GSK2795039具有良好的脑渗透性并能适度改善TBI后急性期神经功能

药代动力学分析显示，TBI后腹腔注射GSK2795039，其在大脑皮层和海马中的浓度分别达到血浆浓度的8.19%和7.01%，表明其具有良好的脑部渗透性。行为学测试发现，虽然GSK2795039治疗组在损伤后第1天的转棒表现仍较差，但在第2和第3天显示出改善趋势，至第3天时，其在棒时间（73.3秒）优于Vehicle组（54.3秒），更接近假手术组水平。在评估空间工作记忆的Y迷宫测试中，GSK2795039治疗组的小鼠表现出对新臂的探索偏好，而Vehicle组则无此差异，提示NOX2抑制对急性期认知功能有积极影响。

NOX2抑制减少损伤大脑中NOX2+ IL-1β+浸润髓系细胞

流式细胞术分析证实，GSK2795039治疗显著降低了TBI后第3天损伤大脑中浸润髓系细胞（CD11b⁺CD45^hi）的NOX2⁺和IL-1β⁺细胞数量。进一步分析显示，这种抑制效果在浸润的中性粒细胞（减少NOX2⁺, IL-1β⁺及双阳性细胞）和单核细胞（减少NOX2⁺细胞）中尤为明显。相比之下，对小胶质细胞（CD11b⁺CD45^int）表型的改善趋势未达到统计学显著性。这表明GSK2795039对外周来源的髓系细胞炎症表型的抑制作用可能强于对脑内常驻的小胶质细胞。

NOX2抑制降低损伤大脑中T细胞IL-1R表达

研究还发现，GSK2795039治疗减少了损伤大脑中CD3⁺ T淋巴细胞的总数，并显著降低了CD4⁺、CD8⁺和CD4^-CD8^- T细胞上IL-1受体（IL-1R）的表达。这一发现提示，NOX2抑制可能通过减少髓系细胞产生的IL-1β，进而削弱了IL-1β/IL-1R信号通路介导的髓系-T细胞交互对话，从而调节了T细胞向脑内的募集和激活。

GSK2795039治疗未能改善TBI后的长期神经功能恢复但轻微减轻慢性神经病理

在长期（至28 DPI）观察中，尽管GSK2795039治疗组在横梁行走测试中显示出脚误次数减少的趋势，并在新物体识别测试中有改善的辨别指数（DI）趋势，但均未达到统计学显著性。组织病理学分析显示，GSK2795039治疗组的皮质损伤体积（10.9 mm3）小于Vehicle组（12.4 mm3），但差异不显著。在海马体体积保留方面，GSK2795039治疗组与假手术组的统计差异小于Vehicle组，表明其可能有一定的长期神经保护趋势，但效果有限。这可能与GSK2795039代谢较快、半衰期短、在慢性期脑内药物暴露不足有关。

综上所述，这项研究系统地阐明了NOX2-ROS-NLRP3炎症小体轴在TBI后神经炎症中的核心作用，并验证了小分子抑制剂GSK2795039靶向该通路的治疗潜力。研究不仅证实了NOX2抑制在体外能有效遏制小胶质细胞的炎症反应，更重要的是，通过高维流式细胞术揭示了GSK2795039在体内能显著抑制浸润髓系细胞（中性粒细胞和单核细胞）的NOX2/IL-1β炎症表型，并调节髓系-T细胞间的相互作用。这些免疫调节作用在急性期（3 DPI）转化为运动功能和空间记忆的改善。然而，该研究也揭示了GSK2795039在临床应用面临的挑战，即其药代动力学特性（快速清除、脑渗透率有限）可能限制了其在慢性期的持续疗效。因此，本研究不仅确认了NOX2-ROS-NLRP3轴及髓系-T细胞交互对话作为TBI神经炎症的有效治疗靶点，也为开发药代性质更优的下一代NOX2抑制剂（如NCATS-SM7270）提供了坚实的理论和实验依据，为最终实现TBI的精准免疫治疗指明了方向。