混合向导RNA提升体内腺嘌呤碱基编辑疗法的特异性与效率

《Nature Biomedical Engineering》：Improved specificity and efficiency of in vivo adenine base editing therapies with hybrid guide RNAs

本刊推荐：研究人员为提升腺嘌呤碱基编辑(ABE)疗法的安全性，系统筛选了可降低脱靶编辑和旁观编辑的混合向导RNA(hybrid gRNA)。研究表明，在苯丙酮尿症(PKU)和弹性假黄瘤(PXE)人源化小鼠模型中，采用ABE8.8 mRNA-脂质纳米颗粒(LNP)递送优选混合gRNA，可在提高靶向编辑效率的同时显著降低脱靶风险，为遗传病基因治疗提供了新策略。

　　

随着CRISPR基因编辑技术的飞速发展，体内碱基编辑已成为治疗遗传性疾病的新兴策略。腺嘌呤碱基编辑器(ABE)能够在不引起DNA双链断裂的情况下，实现A·T到G·C的精确转换，为直接纠正致病性变异带来了希望。早期针对家族性高胆固醇血症的临床试验已证实ABE在人体肝脏中的编辑效力。然而，脱靶编辑和旁观编辑仍然是制约其临床应用的关键安全问题。脱靶编辑可能导致非目标位点的突变，而旁观编辑则可能在目标腺嘌呤附近引入新的致病性变异。尽管第八代腺嘌呤碱基编辑器ABE8.8具有较窄的编辑窗口，但如何同时有效降低脱靶和旁观编辑，仍是提高ABE疗法安全性和效率的核心挑战。

针对这一难题，宾夕法尼亚大学的研究团队在《Nature Biomedical Engineering》上发表了一项重要研究。他们聚焦于苯丙酮尿症(PKU)、弹性假黄瘤(PXE)和遗传性酪氨酸血症1型(HT1)等常染色体隐性遗传病，这些疾病分别与PAH、ABCC6以及FAH和HPD基因相关。研究人员系统评估了临床先导向导RNA(gRNA)在结合ABE后，纠正PAH P281L变异、PAH R408W变异或ABCC6 R1164X变异，或破坏HPD基因(HT1的修饰基因)两个位点时的脱靶编辑谱。为了规避脱靶突变，他们创新性地筛选了带有DNA核苷酸替换的混合gRNA。

研究的关键技术方法主要包括：采用定制化的ONE-seq（寡核苷酸富集测序）技术进行脱靶位点提名；利用混合捕获测序和靶向扩增子测序验证候选位点；通过化学合成含DNA核苷酸替换的混合gRNA；使用脂质纳米颗粒(LNP)包裹ABE8.8 mRNA和gRNA进行体内递送；并在人源化PKU和PXE小鼠模型中评估血液苯丙氨酸和焦磷酸盐水平等生理指标。

优化PAH P281L变异的纠正

研究人员首先针对纠正PAH P281L变异的先导gRNA PAH1进行了深入分析。ONE-seq分析结合靶向测序验证了7个人类基因组位点存在脱靶突变。通过设计21个在间隔序列3-10位点含有单、双或三重DNA核苷酸替换的混合gRNA（PAH1_hyb1至PAH1_hyb21），发现大多数混合gRNA在维持高水平靶向编辑（约90%）的同时，能显著降低旁观编辑（从标准gRNA的4.4%降至约1%），并对脱靶编辑（如PAH1_OT3位点）产生不同程度的影响。

进一步组合三重和双替换，获得了PAH1_hyb22、PAH1_hyb23和PAH1_hyb24三个混合gRNA。在P281L HuH-7肝细胞中，这三者均显著降低了PAH1_OT3脱靶编辑和旁观编辑。值得注意的是，研究还进行了变异感知的脱靶分析，发现标准PAH1 gRNA存在多个由人群遗传变异产生的新脱靶位点风险，而优选混合gRNA（如PAH1_hyb24）能将这些风险位点的ONE-seq分数降至可忽略水平。

在体内实验中，向纯合人源化P281L PKU小鼠注射包裹ABE8.8 mRNA和混合gRNA的LNP（剂量2.5 mg kg^-1）后，PAH1_hyb23和PAH1_hyb24不仅完全逆转了高苯丙氨酸血症，还将肝脏靶向纠正编辑率从40%提升至50-60%，并显著降低了旁观编辑和在小鼠基因组中验证到的脱靶编辑（PAH1_mOT3位点）。

优化ABCC6 R1164X变异的纠正

针对PXE相关的ABCC6 R1164X变异，研究人员设计了类似的混合gRNA系列（PXE1_hyb1至PXE1_hyb21）。在R1164X HuH-7细胞中，多个混合gRNA在维持或提升靶向编辑的同时，降低了在PXE1_OT1和PXE1_OT2位点的脱靶编辑以及旁观编辑。优选出的PXE1_hyb18在体内人源化ABCC6 R1164X小鼠模型中，将肝脏靶向编辑率从24%提升至29%，并降低了在小鼠中验证到的脱靶编辑（PXE1_mOT24位点），同时改善了血液焦磷酸盐水平。

优化HPD基因的靶向

对于HT1修饰基因HPD的失活，研究人员筛选出可高效编辑剪接位点的gRNA（HPD20、HPD3、HPD4、HPD5）。对HPD20和HPD4 gRNA进行混合改造后，获得的HPD20_hyb22、HPD20_hyb23和多个HPD4混合gRNA在维持靶向编辑效率的同时，有效降低了旁观编辑和已验证的脱靶编辑（如HPD4_OT13）。

优化PAH R408W变异的纠正

针对PKU中最常见的PAH R408W变异，由于缺乏合适的NGG PAM，研究人员使用了PAM松弛型的SpRY-ABE8.8编辑器。通过对PAH4 gRNA进行有限的混合改造（PAH4_hyb9至PAH4_hyb21），发现部分混合gRNA能增加靶向编辑并减少有害的旁观编辑，同时改善了ONE-seq脱靶谱，即使在使用PAM松弛型ABE的情况下也是如此。

推广至其他基因位点

为验证该策略的普适性，研究人员将混合gRNA设计（特别是hyb16和hyb17，即在原型间隔区第4、5、6位或第5、6、7位进行DNA核苷酸替换）应用于纠正CPS1 Q335X、CPS1 R780H、ABCC6 R1141X和PAH c.1066-11G>A等额外位点。结果表明，在所有这些案例中，一种或两种混合gRNA均能在维持或提升所需纠正编辑的同时减少旁观编辑，并显著改善ONE-seq脱靶谱。

研究结论与意义

本研究系统评估了针对多种遗传病的临床先导gRNA的脱靶编辑谱，并证明采用混合gRNA策略能显著降低ABE的脱靶编辑和旁观编辑，同时维持或提升靶向编辑效率。这种改善在细胞水平和体内模型中均得到验证，并显示出跨不同基因位点的通用性。研究还强调了变异感知脱靶分析的重要性，以及混合gRNA在缓解由人群遗传变异引发的潜在脱靶风险方面的优势。

尽管本研究存在一定的局限性，例如并非所有位点都可能受益，且其对其他编辑模式（如核酸酶编辑、先导编辑）的适用性仍需验证，但研究结果明确表明，混合gRNA能显著提高某些mRNA-LNP腺嘌呤碱基编辑疗法的安全性和效率。例如，ABE8.8/PAH1_hyb24组合用于治疗PKU的方案，有望在不久的将来进入早期临床试验阶段。这项工作为开发更安全、更高效的体内基因治疗策略提供了重要理论基础和实践方案。