具有可编程信号传导活性的合成受体的计算设计，用于增强癌症T细胞疗法

《Nature Biomedical Engineering》：Computational design of synthetic receptors with programmable signalling activity for enhanced cancer T cell therapy

本研究开发了一种计算蛋白设计平台，用于从头组装可编程的allosteric受体（T-SenSER），以增强CAR-T细胞在肿瘤微环境（TME）中的抗肿瘤响应。通过设计靶向VEGF和CSF1的T-SenSER受体，实验验证了其在体外显著提升STAT5磷酸化水平，并增强T细胞增殖和杀肿瘤能力。体内实验表明，T-SenSER能显著改善小鼠肺癌和骨髓瘤模型中CAR-T细胞的疗效，延长生存期并降低肿瘤负荷。研究为合成生物学和新型免疫疗法设计提供了理论依据和实践指导。

　　肿瘤微环境（TME）在肿瘤进展中扮演着至关重要的角色，其可溶性成分和细胞成分可能会限制CAR-T细胞的功能和持久性。通过设计能够响应TME中可溶性因子的合成蛋白受体，可以增强工程化T细胞的抗肿瘤反应。然而，由于合成蛋白受体的信号特性难以预测，这种方法尚未被广泛研究。在本研究中，我们开发了一种计算蛋白质设计平台，用于从头设计具有可编程输入-输出行为的变构受体，这些受体能够响应TME中的可溶性因子，为T细胞提供共刺激和细胞因子信号，称为TME感知开关受体（T-SenSER）。我们设计了两种T-SenSER，分别针对血管内皮生长因子（VEGF）或集落刺激因子1（CSF1），这些因子在多种肿瘤中均有选择性富集。在肺癌和多发性骨髓瘤（MM）模型中，将CAR与T-SenSER结合，能够增强抗肿瘤反应，这种增强依赖于VEGF或CSF1的浓度。我们的研究为合成生物传感器的加速开发奠定了基础，这些生物传感器可以为基础和转化细胞工程应用提供定制化的感知和响应功能。

在当前的癌症治疗中，基于CAR的T细胞疗法是合成免疫学领域的重要进展。CAR-T细胞能够直接靶向肿瘤细胞，从而在化疗抵抗性疾病的治疗中实现缓解，并改变了B细胞恶性肿瘤和多发性骨髓瘤患者的临床治疗实践。然而，对于B细胞恶性肿瘤，超过一半的患者无法获得长期缓解，而多发性骨髓瘤的疗效仍然有限。在实体瘤中，这种方法的广泛应用仍然缺乏，目前仅有单一的αβ-T细胞受体（TCR）基T细胞疗法在美国获得监管批准，而CAR-T细胞疗法尚未达到这一阶段。

为了实现体内持续的抗肿瘤反应，CAR或TCR转基因T细胞不仅需要识别和杀伤肿瘤细胞，还需要从环境中接收不同的共刺激和细胞因子信号。然而，在大多数肿瘤微环境中，共刺激通常被共抑制所主导，而能够维持T干细胞和中央记忆T细胞群体的细胞因子信号，以及支持效应功能的信号，往往不足或被免疫抑制信号所掩盖。当前的基于TCR的方法仅提供目标抗原识别，并完全依赖环境因素来提供额外的信号。第二代CAR-T细胞的共刺激通常不足以完全补偿缺乏刺激性环境信号的情况。迄今为止，大多数TCR、CAR和共受体结构都是通过经验性方法进行工程设计的，缺乏机制优化和信号功能的多样化，这限制了更强大和精准的细胞疗法的发展。

理论上，这些限制可以通过设计具有完全定制分子特性和相关细胞功能的生物传感受体来克服。现代计算蛋白质设计技术可以工程化具有多种结构和结合特性的蛋白质。然而，除了能够组装成特定超分子结构的蛋白质材料外，这些方法大多仅应用于单一蛋白质结构域。设计具有多结构域的二聚化信号受体仍然具有挑战性。为了确保信号传导，这些受体功能的正确协调需要特定的配体诱导蛋白结合、结构转换和结构域之间的长程通信。这些特性对于开发能够精确控制细胞活动的生物传感器至关重要，但此前尚未受到重视。

在本研究中，我们开发了一种计算方法，用于从头设计具有可编程信号功能的多结构域受体。我们将该方法应用于设计一类受体，称为T-SenSER，这些受体能够检测并结合TME中的可溶性因子，并将共刺激和常见γ链细胞因子信号传递给工程化的T细胞。我们选择了两种不同的可溶性因子，血管内皮生长因子A（VEGFA）和集落刺激因子1（CSF1），它们在多种血液系统和实体肿瘤中均有丰富的表达。当与不同的CAR共表达时，T-SenSER能够以TME响应的方式增强CAR-T细胞的效力和特异性。

为了验证我们的设计方法和假设，我们首先分析了天然血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）、集落刺激因子1受体（CSF1R）和c-MPL受体的拓扑结构和各个结构域的特性。虽然完整的受体结构尚未被确定，但已有部分结构域被表征。VEGFR2和CSF1R均包含免疫球蛋白样结构域，其中D2和D3结构域能够与它们的天然配体强结合。我们选择了D2和D3结构域作为VMR和CMR的输入信号区域。对于输出信号，c-MPL同源物的结构和激活机制表明，通过复杂的结构域之间的耦合，能够实现强配体调控和高效的JAK/STAT信号传导。因此，我们推测，最优的生物传感器支架应将c-MPL的天然跨膜结构域与c-MPL的细胞质结构域耦合，而不是将它们与VEGFR2或CSF1R的跨膜结构域耦合。在缺乏结构信息的情况下，我们使用EFDOCK-TM方法从序列中模拟了c-MPL的跨膜结构域，并通过我们的组装方法将整个信号结构域（跨膜+邻近膜+细胞质）组装起来。

接下来，我们创建了一组多样化的嵌合体，以严格测试我们设计完整长度受体支架结构的能力，以及精细调节信号传导的能力。我们的计算流程允许任意组合VEGFR或CSF1R的细胞外结构域，并通过预定义的连接子进行不同的接触密度采样，从而编码不同水平的机械耦合。最终设计返回为动态的构象集合。因此，这种方法提供了一种计算成本较低的方式，以获取生物物理相关的状态，从而评估配体结合触发的信号传导的调节。

我们最终设计了18种嵌合受体支架，其中9种属于每个传感器家族。对于VMR，这些包括直观的拓扑结构，其中结构域顺序保持不变，以及非直观的结构，其中结构域排列和组合与VEGFR不同（例如，VMR_INT和VMR_D7D6）。对于CMR，我们设计了具有不同性质的合成连接子，如长度、结构和序列，与CSF1R不同。我们最初探索了大量新设计的连接子结构和序列，使用超过70万个可能性，结合了先进的深度学习方法，包括ProteinMPNN和S4PRED，以及片段组装方法。从这一初始的计算机筛选中，我们发现连接子的平均螺旋性较低，这是决定耦合性质的关键因素。我们的九种CMR嵌合体结合了这些ProteinMPNN的新设计序列，并采用了一种更有针对性的结构导向方法，整合了来自天然TpoR和CSF1R序列的片段，从而设计了具有更高螺旋性的连接子，并创建了CMR_FL、CMR_INT、CMR_SHORT和CMR_VeryShort。除了CMR_FL_MPNN_helix，唯一来自ProteinMPNN的嵌合体具有螺旋性，ProteinMPNN连接子的计算耦合在CMR结构中未能达到有效编程信号反应所需的阈值。

为了进行深入的实验验证，我们选择了六个具有代表性的构建，以反映数据集和预测结果的范围。对于VMR嵌合体，我们选择了VMR_FL，该构建整合了所有天然的细胞外结构域（D1-D7），并且表现出最优化的预测VEGF反应，同时保持最低的构型活性倾向；VMR_SHORT是该嵌合体的最小版本，其中配体结合结构域（D1-D3）直接连接到跨膜结构域，被选为负对照，因为它预测为对VEGF结合的信号响应较弱；VMR_INT是一种非直观的设计，其中D4直接连接到D7（D1-D4 + D7），因其具有中间性质。我们的计算预测了从VMR_SHORT到VMR_INT再到VMR_FL的渐进性二聚化和耦合性质增强，表明VMR嵌合体支架在将VEGF感知转化为强c-MPL信号方面的能力逐步提升。在CMR设计中，我们选择了CMR_INT，这是信号传导倾向最高的设计；CMR_FL，它在构型和配体诱导活动之间提供了良好的平衡，符合我们的设计目标；以及CMR_SHORT，它表现出最低的二聚化倾向。我们的计算预测了CMR_FL具有最弱的耦合性，因此应该表现出最高的基线活动（图1e）。所有三种CMR变体都具有强二聚化倾向，并预测为在CSF1感知时提供强大的信号反应。

为了评估设计的T-SenSER对CAR-T细胞功能的影响，我们选择了具有最高VEGF信号响应的VMR_FL，以及具有强CSF1响应和最高基线活动的CMR_FL，以促进在缺乏细胞因子的情况下也具有构成性稳态和增强效应功能。为了评估T-SenSER在体内对CAR-T细胞功能的影响，我们建立了具有不同VEGFA或CSF1水平的动物模型，以反映肺癌和骨髓瘤患者的临床情况。在肺癌模型中，我们使用了A549.GFP-ffLuc细胞，这些细胞在体内具有不同的VEGFA水平。在多发性骨髓瘤模型中，我们使用了MM.1S.GFP-ffLuc细胞，这些细胞在体内具有不同的CSF1水平。我们发现，VMR_FL在体内显著增强了CAR-T细胞的抗肿瘤活性，并且在不同的VEGFA水平下表现出增强的肿瘤特异性。CMR_FL在体内显著增强了CAR-T细胞的抗肿瘤活性，并且在不同的CSF1水平下表现出增强的肿瘤特异性。我们的结果表明，通过设计T-SenSER，可以克服TME中缺乏内源性共刺激和细胞因子信号的限制，从而增强CAR-T细胞的抗肿瘤反应。

在肺癌模型中，我们评估了VMR_FL对CAR-T细胞体内功能的影响。在系统性VEGFA低模型中，NSG小鼠接种了A549.GFP-ffLuc.VEGFA-WT细胞，并使用了单剂量的1×10^5 T细胞。生物发光成像（BLI）显示，BBζ CAR-T细胞疗法部分有效，而VMR_FL的添加未表现出显著影响。在系统性VEGFA高模型中，小鼠接种了A549.GFP-ffLuc.VEGFA-OE细胞。使用Δ或BBζ CAR-T细胞的小鼠表现出快速进展的疾病，并在10天内达到实验终点。相比之下，使用BBζ.VMR_FL+ T细胞的小鼠表现出强大的抗肿瘤反应，与VEGFA血清水平的显著下降相关。最重要的是，使用BBζ.VMR_FL+ T细胞的小鼠整体生存率显著提高。在骨髓瘤模型中，我们评估了CMR_FL对CAR-T细胞体内功能的影响。在CSF1阴性模型中，MM.1S.GFP-ffLuc.B2MKO.CSF1-WT小鼠被使用mAPRIL CAR作为模型系统进行治疗。我们发现，mBBζ和mBBζ.CMR_FL治疗组均表现出显著但短暂的抗肿瘤活性，而CMR_FL的共表达未带来额外的好处。因此，与体外结果不同，CMR_FL的构成性基线活动在体内不足以增强mAPRIL CAR-T细胞的效力。为了测试内源性组织水平的人类CSF1是否足以增强CAR.CMR_FL T细胞的抗肿瘤活性，我们使用了NSG-Quad小鼠作为受体，这些小鼠在组织中表达转基因人类CSF1（CSF1内源模型）。我们系统性接种了MM.1S.GFP-ffLuc.B2MKO.CSF1-WT细胞，并使用了全人类重链仅BCMA定向的FHVH33-BBζ或FHVH33-BBζ.CMR_FL T细胞进行治疗，并通过BLI跟踪肿瘤生长。我们发现，在限制剂量下，FHVH33-BBζ.CMR_FL T细胞表现出更强的抗肿瘤反应，并且肿瘤进展显著延迟，小鼠的生存期延长。在CSF1高模型中，与mBBζ或FHVH33-BBζ CAR联合使用CMR_FL也显著改善了小鼠的治疗结果，无论是肿瘤控制还是生存期。

我们的研究结果表明，T-SenSER能够显著增强CAR-T细胞对实体瘤和血液瘤的抗肿瘤活性。通过将CAR与T-SenSER结合，我们能够利用TME中的可溶性因子作为化学信号，激活合成信号传导，从而增强T细胞的共刺激和细胞因子信号。这种方法为未来的癌症治疗提供了新的思路，能够增强T细胞的持久性和功能，从而提高治疗效果。T-SenSER的开发为合成生物学和生物医学研究提供了新的工具，能够精准控制细胞活动，从而实现更高效的治疗。此外，T-SenSER还可以用于其他疾病，如自身免疫疾病和再生医学，以增强细胞疗法的特异性和效果。