SsaE蛋白在鼠伤寒沙门菌生物膜调控与T3SS依赖性毒力中的多效性作用解析

《World Journal of Microbiology and Biotechnology》：Deciphering the role of SsaE in biofilm regulation and T3SS-dependent virulence of Salmonella Typhimurium

本研究针对鼠伤寒沙门菌中T3SS关键组分SsaE蛋白的多功能调控机制展开深入探索。研究人员通过构建ssaE基因缺失突变体，系统阐明了该蛋白在生物膜形成、运动性及上皮细胞粘附等关键致病过程中的核心作用。研究证实SsaE通过调控SPI-2 T3SS功能，同时影响SPI-1相关毒力基因表达，揭示了其作为分子桥梁连接分泌系统活性与适应性表型的新机制。该发现为理解沙门菌环境持久性和致病潜力提供了新的理论依据，对开发抗毒力策略具有重要意义。

　　

在食品安全和公共卫生领域，鼠伤寒沙门菌（Salmonella Typhimurium）始终是备受关注的致病元凶。这种革兰氏阴性杆菌凭借其强大的环境适应能力和多样化的致病机制，在全球范围内引发大量食源性疾病。更令人担忧的是，沙门菌能够形成生物膜（biofilm）——一种由细菌群体构建的"保护堡垒"，使其对抗菌药物和宿主免疫系统产生显著耐受性。在这一复杂致病过程中，III型分泌系统（Type III Secretion System, T3SS）发挥着至关重要的作用，它如同分子注射器，将效应蛋白直接注入宿主细胞，操纵细胞功能以利于细菌生存和繁殖。

沙门菌基因组中含有两个主要的致病岛（Pathogenicity Island）——SPI-1和SPI-2，分别编码两套不同的T3SS装置。其中，SPI-2编码的T3SS对于细菌在巨噬细胞内的存活和系统性感染尤为关键。在这一系统中，ssaE基因编码一种小型胞质蛋白，传统上被认为具有分子伴侣（chaperone）功能，负责稳定效应蛋白并促进其分泌。然而，越来越多的证据表明，T3SS组分可能具有超出其经典功能的调控作用，特别是与细菌的环境适应和群体行为相关。此前研究观察到，在dam甲基化酶突变株中，ssaE表达水平显著降低，且伴随生物膜形成能力下降，这提示SsaE可能参与调控沙门菌的多细胞行为。

基于这一科学假设，安卡拉大学的研究团队在《World Journal of Microbiology and Biotechnology》上发表了最新研究成果，系统揭示了SsaE蛋白在鼠伤寒沙门菌生物膜调控和T3SS依赖性毒力中的多功能作用。研究团队采用分子生物学、细胞生物学和生物信息学等多学科方法，构建了ssaE基因缺失突变体（ΔssaE）及其回补株（pBAD24::ssaE），通过表型分析、基因表达检测和蛋白互作预测，全面评估了SsaE对细菌生理和致病特性的影响。

研究采用的关键技术包括：基因敲除与回补株构建、生长曲线与生物膜定量分析、运动性测定、细菌自聚集与共聚集实验、上皮细胞粘附评估、qPCR基因表达分析、蛋白互作网络构建与分子对接预测。其中，上皮细胞粘附实验使用了人肠上皮细胞Caco-2和喉上皮细胞HEp-2两种细胞系，通过共聚焦显微镜观察细菌定植情况。

分子确认ssaE基因缺失与回补

研究首先通过PCR验证了ssaE基因缺失突变体的成功构建，证实氯霉素抗性 cassette 已准确整合至ssaE基因座。回补株中，ssaE基因被克隆至阿拉伯糖诱导型载体pBAD24，并通过限制性酶切和连接反应引入ΔssaE突变体，经PCR确认160bp的ssaE片段成功表达。

比较生长曲线分析

生长曲线分析显示，ΔssaE突变体进入指数期的时间延迟，但最终细胞密度与野生型无显著差异，表明ssaE缺失不影响基础代谢，但可能影响应激适应和毒力相关增殖过程。回补株基本恢复了野生型的生长动力学特征。

生物膜生产分析

定量生物膜分析显示，ΔssaE突变体在所有检测时间点（24-120小时）均表现出显著的生物膜形成缺陷，减少幅度达37.1%-59.5%。回补株使生物膜生产能力恢复达95%，证实了表型缺陷的特异性。

表型评估

通过刚果红染色、钙荧光白染色和菌膜形成实验，研究发现ΔssaE突变体的菌落形态由典型的rdar（红色、干燥、粗糙）型转变为bdar（棕色、干燥、粗糙）型，表明纤维素产量显著降低。菌膜形成能力也明显减弱，形成的菌膜薄而脆弱。回补株基本恢复了这些表型特征。

游动和集群运动

在不同温度下（20℃、28℃、37℃）进行的运动性实验表明，ΔssaE突变体的游动和集群运动能力均显著受损，最高减少达75.73%。回补株使运动能力恢复55.92%-81.96%，证实SsaE对鞭毛功能和细胞外基质相关运动均有调控作用。

自聚集和共聚集系数测定

ΔssaE突变体的自聚集能力降低（37.7% vs 野生型44.1%），与乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）的共聚集能力也轻微下降。回补株使这些表型接近野生型水平，表明SsaE影响细菌的表面粘附特性。

细菌对Caco-2和HEp-2细胞的粘附

细胞粘附实验显示，ΔssaE突变体对Caco-2和HEp-2上皮细胞的粘附能力分别下降至野生型的31.6%和38.5%。共聚焦显微镜观察证实，野生型和回补株能在上皮细胞表面形成密集的微菌落，而突变体粘附显著减少。回补使粘附能力基本恢复，表明SsaE在上皮定植中发挥关键作用。

蛋白-蛋白相互作用网络分析

STRING数据库分析揭示SsaE与多种沙门菌毒力因子存在直接或间接相互作用，包括SPI-2结构组分（SsaD、SsaC、SsaB等）、调控蛋白（SsrA、SsrB）以及SPI-1相关因子（InvA、HilA）。网络拓扑分析识别出SsrA、SsaG和SsaB等枢纽蛋白，表明SsaE处于毒力调控网络的核心位置。

蛋白-蛋白对接分析

分子对接预测显示SsaE与InvA、SsaJ、SsrA等蛋白具有高结合能和结构兼容性，结合能最低达-1484.8 kcal/mol。这些相互作用涉及静电互补和界面接触，支持SsaE可能参与分泌机器组装和效应蛋白识别的假设。

ssaE突变体的基因表达差异

qPCR分析显示，ΔssaE突变体中ssaB、yaiC、csgD、hilA和invA基因的表达分别下调4.82、3.92、2.44、4.08和5.06倍，而rpoS表达无显著变化。这表明SsaE特异性调控毒力和生物膜相关基因，而非一般应激反应。

本研究通过多角度实验证实SsaE是鼠伤寒沙门菌中一个多功能调控因子，远超出其作为SPI-2 T3SS分子伴侣的经典角色。研究发现SsaE通过影响细菌生长动力学、生物膜形成、运动能力、聚集特性和上皮粘附等多种表型，在沙门菌环境适应和致病过程中发挥核心作用。分子机制上，SsaE与SPI-1和SPI-2系统组分均存在相互作用，并能调控关键毒力基因（如ssaB、hilA、invA）和生物膜相关基因（如csgD、yaiC）的表达。

特别值得注意的是，SsaE在dam突变体中的表达下调提示其可能受到表观遗传调控，这为理解环境信号如何整合进毒力调控网络提供了新视角。蛋白互作网络和对接分析进一步支持SsaE作为分子枢纽，连接分泌系统活性与适应性表型的生物学功能。

这项研究的重要意义在于揭示了T3SS组分的新型调控功能，拓宽了对沙门菌致病机制的理解。SsaE作为连接细菌细胞内寄生生活方式与环境适应策略的关键分子，可能成为抗毒力治疗的潜在靶点。未来通过转录组学、蛋白质组学和体内感染模型的深入研究，将进一步完善对SsaE在多方面生物学过程中的精确调控机制的理解，为控制沙门菌感染提供新策略。