葡萄胚珠木质素生物合成与无核性状的关联研究：组织学与转录组学联合分析

《Scientia Horticulturae》：Histological and transcriptomic analyses of lignin biosynthesis in stenospermocarpic seedless and seeded grape ovules

本研究针对葡萄无核育种中胚败育机制不清的关键问题，通过组织学和转录组学技术，系统比较了无核品种‘中葡18号’和有核品种‘玫瑰香’的胚珠发育过程。研究发现，胚败育关键期（开花后55-58天）木质素沉积不足和维管连接异常是导致无核性状的重要原因，并筛选出MYB、PAL、4CL等调控木质素合成的关键候选基因，为葡萄无核育种提供了重要靶点和理论依据。

　　

葡萄（Vitis vinifera L.）作为全球最重要的水果作物之一，其无核品种因其食用方便、口感佳而备受消费者青睐。在无核葡萄中，绝大多数属于stenospermocarpic（狭义的种子败育型）类型，即虽然完成了正常的授粉受精过程，但胚胎在早期发育阶段发生败育，最终形成软籽或无籽的果实。然而，导致胚胎败育的分子机制，尤其是胚珠种皮木质化过程与胚胎存活之间的关系，尚不完全清楚。解析这一机制对于提高无核葡萄育种效率，特别是利用胚胎挽救技术进行杂交育种具有重要意义。

为了深入探究这一问题，中国农业科学院郑州果树研究所的研究团队在《Scientia Horticulturae》上发表了最新研究成果。该研究选取了典型的stenospermocarpic无核葡萄品种‘中葡18号’（ZP）和有核品种‘玫瑰香’（MH）作为研究对象，通过系统的组织学、生物化学和转录组学分析，揭示了木质素生物合成在葡萄胚珠发育中的关键作用及其与胚胎败育的因果关系。

研究人员主要运用了形态学测量、组织切片观察、木质素含量测定、转录组测序（RNA-seq）以及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证等关键技术方法。样本来源于在河南新乡试验基地和国家葡萄种质资源圃种植的六年生‘ZP’和‘MH’葡萄树，在开花后15、25、35、45、55、58、61和64天等多个时间点系统采集了自然授粉的葡萄胚珠。

3.1. 葡萄果实和胚珠的形态学分析

通过观察‘ZP’和‘MH’浆果和胚珠的发育动态，研究发现‘ZP’的胚珠在开花后15至45天经历快速生长期，之后生长停滞。在整个发育过程中，‘ZP’胚珠的重量和尺寸均显著小于‘MH’。组织学分析进一步揭示，‘ZP’的胚胎败育始于开花后58天左右，到61-64天时胚胎和胚乳完全退化。此外，解剖学比较发现，‘MH’胚珠的维管束在开花后25天就直接与内皮层（endotesta）连接，而‘ZP’的维管连接在整个发育期（15至64天）都通过中种皮（mesotesta）维持，这种异常的维管结构可能降低了营养运输效率，从而导致胚胎败育和种痕形成。

3.2. 葡萄胚珠木质素含量和沉积的比较

对胚珠木质素含量的测定显示，从开花后35天开始，‘MH’胚珠的木质素含量急剧增加并持续处于高水平，而‘ZP’胚珠的木质素含量在整个发育期间均显著低于‘MH’，相差约2.3至3.3倍。组织学观察结果与此一致：开花后35天，‘MH’的内皮层出现广泛的木质化沉积和增厚（染色面积占比56.81%），而‘ZP’仅在内皮层局部区域有有限的木质素沉积（染色面积占比2.11%）。这些结果表明，‘ZP’胚珠木质化过程延迟且不充分，这可能是导致其种皮发育受损和软籽表型的重要原因。

3.3. 四个发育阶段葡萄胚珠的转录组分析

对四个关键发育阶段（35, 45, 55, 61 DAF）的胚珠进行转录组测序，主成分分析（PCA）显示‘ZP’和‘MH’样本能明显区分。差异表达基因（DEGs）分析发现，在胚胎败育关键期（ZP55_vs_MH55），DEGs数量最多（7502个），表明此阶段两品种间转录组差异最大。

3.4. DEGs的GO和KEGG功能比较

GO（Gene Ontology）富集分析显示，四个比较组（ZP vs MH在不同时间点）的DEGs均显著富集在“木质素生物合成过程”和“苯丙烷类生物合成过程”等通路。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析进一步表明DEGs在“苯丙烷生物合成”、“植物激素信号转导”等通路显著富集，提示这些通路在两种葡萄胚珠发育差异中起重要作用。

3.5. 木质素生物合成相关DEGs的表达分析

研究人员从转录组数据中鉴定出51个与木质素生物合成相关的基因。表达谱分析显示，多个关键基因（如4CL LOC100266547、HCT LOC100264063、CCoAOMT LOC100262946等）在‘ZP’中的表达量在整个发育阶段均维持在较低水平，而在‘MH’中则在开花后35天出现表达高峰后逐渐下降。特别是PAL (LOC100233012)、4CL和CAD (LOC100250644) 在‘ZP’中的所有时间点的表达量均显著低于‘MH’。此外，研究还鉴定出59个MYB转录因子，其中LOC100246160等三个候选MYB在‘MH’中（尤其在35 DAF）高表达，而在‘ZP’中表达量低。相关性分析和启动子顺式元件分析表明，LOC100246160可能通过结合PAL和4CL基因启动子区的AC顺式元件（AC-I: ACCTACC, AC-II: ACCAACC）来激活其表达，从而调控木质素合成。

3.6. 通过qRT-PCR验证RNA-Seq结果

qRT-PCR对12个候选基因表达水平的验证结果与转录组测序数据（FPKM值）高度一致，证实了测序结果的可靠性。

本研究通过多组学联合分析，明确了木质素生物合成缺陷是导致stenospermocarpic葡萄‘中葡18号’胚胎败育的关键因素。在胚胎败育的关键窗口期（开花后55-58天），‘ZP’胚珠由于木质素积累不足以及维管束与内皮层连接异常，阻碍了营养物质向胚珠的有效运输，最终引发胚乳和胚胎的败育。转录组分析筛选出的关键基因，特别是MYB转录因子LOC100246160及其可能调控的下游基因PAL (LOC100233012)和4CL，构成了一个潜在的调控模块。这些基因在‘ZP’中的低表达直接关联到木质素合成途径的抑制。

该研究不仅深化了对葡萄无核性状形成分子基础的理解，而且为通过分子育种手段精准调控胚珠发育、提高无核葡萄育种效率（尤其是胚胎挽救技术的成功率）提供了新的理论依据和关键的候选基因靶点。未来的研究可通过基因过表达、基因编辑（如CRISPR/Cas9）等功能验证实验，进一步确认这些候选基因在木质素合成和胚胎发育中的具体作用，从而推动葡萄无核育种技术的发展。