基于双表位印迹聚合物@AuNP-MoS2纳米片-EQCM传感器的高选择性免抗体检测伤寒沙门菌SipD蛋白研究

《Sensing and Bio-Sensing Research》：A dual epitope-imprinted polymer@AuNP-MoS 2 nanosheets-EQCM sensor for antibody free detection of SipD protein of Salmonella typhi bacteria with high selectivity

本研究针对伤寒沙门菌感染诊断中存在的特异性差、灵敏度低等问题，开发了一种基于双表位印迹聚合物@AuNP-MoS2纳米片-EQCM传感器的新型检测平台。该研究通过分子对接筛选单体，采用双模板印迹技术制备传感器，实现了对SipD蛋白的高灵敏（检测限达0.025 nM）、高选择性检测，在真实血样中表现优异，为传染病快速诊断提供了新策略。

　　

伤寒热作为一种由伤寒沙门菌（Salmonella typhi）引起的急性发热性疾病，至今仍是发展中国家面临的重大公共卫生威胁。传统的诊断方法如血培养灵敏度有限（40-60%），而广泛使用的Widal试验在COVID-19疫情期间曾出现假阳性结果，凸显出现有诊断技术的不足。开发高灵敏、高选择性的新型检测方法对于伤寒的早期诊断和疫情防控具有重要意义。

在这项发表于《Sensing and Bio-Sensing Research》的研究中，来自巴纳拉斯印度教大学的研究团队创新性地开发了一种双表位印迹电化学石英晶体微天平（DEIP-EQCM）传感器，用于伤寒沙门菌SipD蛋白的免抗体检测。该研究通过计算模拟指导实验设计，将分子印迹技术与纳米材料相结合，实现了对细菌蛋白的高性能检测。

研究人员采用的主要技术方法包括：通过分子对接筛选最优单体组合；合成金纳米粒子修饰的二硫化钼纳米片（AuNPs-MoS₂NSs）作为传感基底；利用自组装单层技术固定半胱氨酸标记的表位肽；通过电沉积法制备双表位印迹聚合物薄膜；采用EQCM实时监测分子结合过程。研究使用了伤寒感染患者和健康人的临床血样进行验证。

3.1. 结构分析与分子对接研究

通过同源建模获得了SipD蛋白的三维结构，Ramachandran图显示90.2%的氨基酸残基位于有利区域。分子对接结果表明，BMA和MPC单体与两个表位序列（WC-15和NC-15）具有最高的结合亲和力，分别为-3.7/-4.4 kcal/mol和-3.9/-3.8 kcal/mol。这些单体通过π-π堆积、氢键等相互作用与表位肽结合，为印迹聚合物的制备提供了理论基础。

3.2. 印迹电极的设计与制备

研究团队合成了AuNPs-MoS₂NSs纳米复合材料作为传感基底，通过半胱氨酸的巯基化学将表位肽固定于基底表面。选择BMA、MAA和MPC作为功能单体，NNMBA作为交联剂，通过电沉积法在EQCM电极表面形成双表位印迹聚合物薄膜。循环伏安法监测显示，经过10个沉积循环后，聚合物薄膜达到稳定状态。

3.3. 肽段从印迹基质中的提取

通过PBS缓冲液冲洗实现了模板肽段的提取，EQCM频率变化表明肽段成功从聚合物基质中移除。荧光光谱和高效液相色谱分析进一步验证了提取效果。接触角测量显示，提取后的DEIP电极表面亲水性增强（接触角54.5°），表明功能基团暴露增加了表面亲水性。

3.4. DEIP和NIP修饰EQCM电极的结合亲和力

结合实验表明，DEIP电极对两个表位肽都表现出特异性结合，频率变化分别为-300 Hz（WC-15）和-350 Hz（NC-15），而NIP电极则无明显结合信号。印迹因子计算显示，WC-15和NC-15的IF值分别为6.93和7.00，证明印迹效果显著。吸附等温线符合Freundlich模型，表明结合位点存在异质性。

3.5. 分析应用

传感器在100-1000 nM浓度范围内呈现良好线性关系，检测限分别为1.65 nM（WC-15）和0.025 nM（NC-15），定量限为5.03 nM和0.075 nM，灵敏度优于以往报道的检测方法。

3.6. 对潜在竞争分子的交叉选择性

选择性实验表明，DEIP传感器对错配肽段和血浆蛋白（甲状腺球蛋白、白蛋白等）均无响应，仅对目标表位肽表现出特异性结合，证明其优异的选择性。血液样本的老化效应对检测性能影响不显著。

3.7. 真实样本分析

在伤寒感染患者血样检测中，DEIP传感器表现出明显的频率降低（-548 Hz），而健康人血样则无此现象。SDS-PAGE分析证实了SipD蛋白的特异性捕获，在29.0 kDa处出现特征条带。与现有检测方法相比，该传感器具有更低的检测限和更好的实用性。

3.8. 重现性与稳定性测试

经过60天的储存和多次吸附-解吸循环后，传感器仍保持良好的检测性能，表明印迹空腔的结构稳定性，适合实际应用。

该研究成功开发了一种基于双表位印迹技术的EQCM传感器，实现了对伤寒沙门菌SipD蛋白的高灵敏、高选择性检测。通过计算模拟指导的实验设计，结合纳米材料增强的传感平台，该传感器在真实血样中表现出优异的性能，检测限达到亚纳摩尔水平。与传统抗体依赖的检测方法相比，这种免抗体检测策略具有更好的稳定性和更低的成本。更重要的是，双表位印迹策略显著提高了检测的选择性，使其能够区分目标蛋白与其他结构类似物，在复杂生物基质中仍保持高性能。这项研究不仅为伤寒的早期诊断提供了新工具，也为其他传染病的新型检测方法开发提供了重要参考。分子印迹技术与纳米材料、传感技术的结合，展现了合成受体在生物医学检测领域的巨大应用潜力。