单链整合素激活抗体scTS2/16通过增强β1整合素功能促进类器官在基质胶和胶原水凝胶中的生长

《Nature Biotechnology》：A single-chain derivative of an integrin-activating antibody potentiates organoid growth in Matrigel and collagen hydrogels

本研究针对当前人类上皮类器官培养依赖异种来源、化学成分不明确的基质胶（Matrigel）等问题，开发了一种单链变体抗体scTS2/16，通过变构激活整合素β1功能，使胃肠道类器官在基质胶中的产量提高5倍，在临床级胶原I水凝胶中产量提升6-7倍，为类器官的临床转化提供了标准化解决方案。

　　

在再生医学和疾病建模领域，类器官技术被誉为革命性的突破。这些微小的、自组织的上皮组织迷你版本能够在体外长期扩增，模拟人体器官的结构和功能。然而，类器官培养至今仍面临一个关键瓶颈：其依赖基质胶（Matrigel）作为细胞外基质（ECM）支撑。基质胶是小鼠肉瘤的提取物，存在异种来源、化学成分不明确、批次间差异大以及伦理问题，严重限制了类器官在临床治疗中的应用前景。类器官与细胞外基质的相互作用主要通过整合素受体介导，其中β₁整合素在传递细胞外信号、维持细胞极性和促进增殖方面起着核心作用。那么，能否找到一种方法，在不依赖基质胶的情况下，有效激活整合素信号通路，从而推动类器官在化学成分明确、临床级材料中的生长呢？

针对这一挑战，荷兰胡布勒支研究所的Hans Clevers团队在《Nature Biotechnology》上发表了一项创新性研究。研究人员将目光投向了一种已知能激活整合素β₁的抗体——TS2/16。该抗体最初在白细胞中发现能增强细胞粘附。研究团队对其进行了工程化改造，开发出一种单链可变片段（scFv）版本的抗体，称为scTS2/16。这种单链抗体不仅保留了其母体抗体的激活功能，而且能够在大肠杆菌中高效表达，易于生产纯化。

为了验证scTS2/16的效果，研究人员首先测试了其对类器官极性和生长的影响。他们发现，使用抑制性抗体AIIB2（能使β₁整合素稳定在低亲和力构象）会迅速导致类器官从“基底向外”的极性逆转为“基底向内”，并完全抑制类器官的生长和增殖。相反，当在标准基质胶培养体系中加入scTS2/16时，所有来源于胃肠道（包括胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠）以及胰腺和肝脏的类器官，其生长产量均得到显著提升，在基质胶中最高可增加5倍。

研究的更大突破在于scTS2/16使得类器官能够在纯化的胶原I水凝胶（如PureCol EZ Gel）中高效生长。胶原I是化学成分明确、易于获得临床级标准的材料。研究人员证明，scTS2/16通过激活α₂β₁整合素（胶原的主要受体）来增强类器官细胞与胶原的粘附。通过CRISPR-Cas9技术敲除ITGA2基因（编码整合素α₂亚基）后，类器官在胶原中的生长被完全抑制，证实了该通路的关键作用。更重要的是，scTS2/16能够支持从原代结肠和肝脏活检组织直接分离的细胞在胶原I水凝胶中成功形成类器官，并且产量显著高于对照组。

此外，该研究还成功将类器官培养从3D体系拓展到2D体系。在胶原I包被的Transwell小室上，添加scTS2/16能够维持类器官细胞的长期扩增（连续传代超过4次），并且这些细胞在分化诱导后仍能产生所有主要的肠道特化细胞类型，如肠上皮细胞、潘氏细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞，其分化能力与在基质胶上培养的细胞相当。转录组测序分析表明，scTS2/16的处理并未引起类器官细胞基因表达的显著偏移，说明其主要是通过增强整合素信号促进生长，而非改变细胞命运。

本研究的关键技术方法主要包括：利用杂交瘤测序和基因合成技术构建人源化IgG1和单链scFv版本的TS2/16抗体，并通过原核（大肠杆菌）和真核（HEK293）表达系统进行蛋白纯化；采用细胞粘附实验（如K562细胞系）和类器官培养模型（3D和2D）进行功能验证；运用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建ITGA2基因敲除的类器官细胞系；通过免疫荧光染色、qPCR、流式细胞术和批量RNA测序等技术分析类器官的极性、增殖、分化和转录组特征。研究中使用的原代类器官来源于经患者知情同意的结肠和肝脏活检组织（UMCU伦理委员会批准）。

scTS2/16增强肠道类器官在BME中的生长

研究人员首先在标准BME培养体系中测试了scTS2/16的效果。BME的主要成分包括层粘连蛋白-111（Ln-111）和胶原IV。实验表明，scTS2/16能以浓度依赖的方式增强结肠类器官细胞与BME包被表面的粘附，最大效应在2 nM浓度下达到。使用抑制性抗体AIIB2则完全阻断了这种粘附。进一步研究发现，抑制整合素α₆亚基（与Ln-111结合的关键受体）的抗体GoH3会强烈抑制类器官的生长，而添加scTS2/16则能使类器官生长增加3倍。更重要的是，scTS2/16显著提高了单细胞克隆的形成效率，这在类器官培养中通常是非常低效的步骤。

BME培养的胃肠道不同部位类器官均依赖β₁整合素

为了验证scTS2/16效果的普适性，研究团队测试了来源于胃肠道不同部位的类器官，包括胃、十二指肠、空肠、回肠、胰腺导管和肝脏胆管类器官。在所有测试的类器官类型中，均观察到抑制性抗体AIIB2对生长的抑制和scTS2/16对生长的增强作用。这表明整合素β₁信号通路在多种上皮类器官的生长中均扮演着关键角色。转录组分析也证实，scTS2/16的处理并未引起类器官基因表达的显著改变，说明其作用是促进增殖而非诱导分化。

scTS2/16抗体促进已建立和原代分离的结肠类器官在胶原I水凝胶中的生长

研究的核心突破是scTS2/16使得类器官能够在胶原I水凝胶中生长。胶原I通过整合素α₂β₁被细胞识别。研究人员证实，scTS2/16能增强类器官细胞与胶原I的粘附，而这种粘附可被AIIB2抗体抑制。通过CRISPR-Cas9技术敲除ITGA2基因后，类器官在胶原中的生长被完全抑制，即使在scTS2/16存在下也是如此，明确了α₂β₁整合素在此过程中的必要性。从原代结肠和肝脏活检组织直接分离的细胞在胶原I中培养时，添加scTS2/16能显著提高类器官的形成效率。通过优化培养基成分（添加IGF1、FGF2、CHIR和福斯高林等），研究团队实现了类器官在胶原中的长期传代培养，并且这些类器官保持了多向分化潜能。

2D胶原培养体系中的长期培养

研究还成功地将类器官培养拓展到2D体系。在胶原I包被的Transwell小室上，scTS2/16能够支持结肠、十二指肠和空肠类器官细胞的长期扩增，连续传代超过4次，且增殖速度显著高于对照组。这些长期培养的细胞在诱导分化后，仍能生成所有主要的肠道特化细胞，证明其干性维持良好。转录组分析再次确认，2D培养体系中的类器官细胞在scTS2/16处理下保持了转录组的稳定性。

本研究通过开发一种单链整合素激活抗体scTS2/16，成功解决了类器官培养中对基质胶的依赖问题。该抗体通过变构激活整合素β₁，增强类器官与细胞外基质（特别是胶原I）的相互作用，从而在化学成分明确、临床级标准的水凝胶中实现类器官的高效生长和长期扩增。这一技术不仅显著提高了类器官在传统基质胶中的产量，更重要的是，它为类器官的临床转化应用铺平了道路。由于scTS2/16可以在大肠杆菌或HEK293细胞中生产，易于生成临床级批次，且胶原I已是广泛可用的临床级材料，因此该组合策略有望推动基于类器官的细胞治疗（如溃疡性结肠炎的治疗、放射性口干症的治疗等）走向现实。此外，移植前用scTS2/16处理类器官细胞，可能通过诱导整合素的高亲和力状态而提高其植入效率。这项研究不仅提供了一种改进类器官培养的强大工具，更开辟了整合素生物学在再生医学中的应用新途径。