未蒸发的电子液体中的毒性物质会增强CD44依赖性的透明质酸分解基因表达，并在人类声带成纤维细胞中引发炎症

《Toxicology Letters》：Unvaporized e-liquid toxicity elevates CD44-dependent hyaluronan catabolic gene expression and triggers inflammation in human vocal fold fibroblasts

研究未气化电子烟液体对人类声带成纤维细胞（hVFF）的影响，发现短期暴露（24h）抑制透明质酸合成基因（HAS1/2/3）和降解基因（HYAL2/CD44），降低透明质酸水平；长期暴露（72-96h）上调HAS3和HYAL2/CD44，导致低分子量透明质酸积累及炎症反应，揭示电子烟通过氧化应激和ECM代谢紊乱引发声带纤维化。

　　电子烟和电子液体（e-liquid）的暴露已被与声带炎症和声音障碍（dysphonia）相关联，然而目前尚无针对此类问题的定向非手术治疗方法。本研究聚焦于透明质酸（hyaluronan，简称HA）在人体声带纤维母细胞（human vocal fold fibroblasts, hVFFs）中的代谢调控机制，特别是电子烟液暴露对HA代谢相关基因表达的影响。HA是细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的重要组成部分，对于维持声带结构、修复和功能具有关键作用。在炎症状态下，HA的代谢往往出现异常，但其在电子烟液暴露后的基因响应机制尚未被系统研究。因此，理解HA代谢基因在电子烟液毒性下的表达变化，对于开发针对电子烟相关声带炎症的新药物发现策略具有重要意义。

为了规避传统蒸汽模型中热降解和气溶胶变化可能带来的干扰因素，本研究采用未蒸发的电子烟液（含尼古丁，浓度范围为0.125至1 mg/mL）对hVFFs进行24小时暴露，观察到浓度依赖性的细胞形态变化和细胞活力下降（p < 0.05）。通过测定半数致死浓度（LC??），确定了0.437 mg/mL为电子烟液对hVFFs产生毒性作用的关键浓度，并以此浓度进行短期（24小时）和长期（72至96小时）暴露实验。长期暴露导致细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）增加、炎症反应增强、胶原蛋白降解受阻，并促使胶原蛋白1（Col1A1）与胶原蛋白3（Col3A1）的比例上升，这提示了可能的纤维化重塑现象。相比之下，短期暴露则抑制了HA合成酶（HAS1、HAS2、HAS3）和降解相关基因（HYAL2、CD44），从而降低了细胞外HA的水平。而长期暴露则进一步抑制了HAS1和HAS2的表达，同时上调了HAS3、CD44和HYAL2的表达，表明HA降解增强并伴随低分子量HA（LMW-HA）的积累，这可能与促炎反应有关。此外，CD44的沉默显著降低了IL-8的mRNA表达，验证了CD44在hVFFs炎症中的作用。这些发现首次揭示了未蒸发电子烟液对hVFFs中HA代谢的调控机制，为声带炎症的生物标志物识别和靶向治疗提供了理论依据。

声带是呼吸系统中非常重要的结构，其功能受到多种因素的影响，包括电子烟液的暴露。电子烟液通常由尼古丁、调味剂以及丙二醇（PG）和植物甘油（VG）等载体溶剂组成。在传统电子烟中，这些成分在加热过程中会发生热降解，产生如甲醛、乙醛和丙烯醛等有害副产物，其中许多已被确认为致癌物。因此，气溶胶形式的电子烟液往往含有更多的有毒化合物，其化学成分的变化主要源于设备特定的加热条件。相比之下，未蒸发的电子烟液化学反应性较低，为可控毒理学筛查提供了更为稳定的基质。直接使用电子烟液可以实现对各成分浓度的精确控制，从而有助于重复剂量实验和对单个成分（如尼古丁、调味剂、PG/VG）的针对性评估。此外，未蒸发的电子烟液可以避免气溶胶生成带来的变量干扰。

hVFFs是声带黏膜下层（lamina propria）的主要细胞类型，它们在炎症反应中发挥关键作用，并且对维持声带的细胞外基质具有重要作用。这些细胞在电子烟导致的声带疤痕形成过程中特别容易受到损伤。HA是一种粘弹性糖胺聚糖，广泛存在于声带黏膜下层，对发声、保湿和组织完整性具有调节作用。HA的合成由三种同工酶（HAS1、HAS2、HAS3）介导，这些酶的表达水平在生理状态下通常以HAS2为主导，促进高分子量HA（HMW-HA）的产生，从而支持组织保湿、减少声带振动时的摩擦并抑制炎症信号。然而，在病理状态下，如疤痕形成或暴露于环境毒素时，hVFFs可能会转向更高的HAS3表达，导致低分子量HA（LMW-HA）的积累，这会促进成纤维细胞的激活、细胞因子释放以及细胞外基质的硬化。这种HA代谢的变化往往伴随着CD44和水解酶的上调，进一步放大了炎症反应和组织重塑过程。HAS酶的转录调控受到多种因素的影响，如p53、p63和转化生长因子β1（TGF-β1），这些因子能够根据细胞应激和损伤调整HA的合成。因此，理解HA合成和降解的分子机制对于揭示声带疾病的发生机制并开发针对性治疗策略至关重要。

HA通过与它的主要受体CD44结合来发挥其生物学功能，CD44存在两种主要的异构体：标准型（CD44s）和变体型（CD44v）。这两种异构体激活了不同的信号通路，涉及细胞增殖、迁移和炎症反应。HA的降解主要通过两种机制实现：一是依赖CD44的途径，包括水解酶HYAL1和HYAL2的作用；二是通过ROS介导的氧化裂解。在CD44依赖的降解过程中，HYAL2会将细胞外的HA分解为中间片段，随后被HYAL1在溶酶体中进一步降解。尽管已有研究报道了传统香烟烟雾对hVFFs中HA代谢的影响，但目前尚无关于电子烟或电子液体如何影响HA合成和降解相关基因表达的文献。因此，本研究旨在通过体外实验，探讨未蒸发电子烟液对hVFF细胞中HA代谢相关基因表达的影响，从而提供关于电子烟相关声带病理的机制性见解。

为了评估电子烟液对hVFFs的影响，本研究采用了一系列实验方法，包括细胞培养、细胞活力检测、ROS检测、定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）和胶原酶活性测定等。hVFFs细胞培养采用了含有4.5 g/L葡萄糖、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的Dulbecco改良 Eagle培养基（DMEM），并在37°C、5% CO?的条件下进行培养。细胞活力检测采用WST-1方法，通过测量细胞内线粒体脱氢酶对四唑盐的代谢能力来评估细胞活性。ROS水平通过DCFH-DA荧光探针进行检测，利用微孔板读数仪在特定波长下测量荧光强度，并将其归一化为总蛋白浓度以消除细胞密度和代谢活性的差异。qRT-PCR用于检测HA合成和降解相关基因的表达水平，包括HAS1、HAS2、HAS3、CD44、HYAL2、TGFβ1、IL-8、Col1A1和Col3A1等。通过计算ΔΔCt方法，并以HPRT1作为内参基因，对各基因的表达变化进行了定量分析。胶原酶活性则通过商业化的胶原酶检测试剂盒进行测量，使用合成肽底物FALGPA评估酶的活性。此外，通过使用CD44特异性siRNA进行转染，研究了CD44在炎症反应中的作用，发现其沉默可显著降低IL-8的表达水平，进一步支持了CD44在HA介导的炎症信号中的重要性。

实验结果表明，电子烟液暴露对hVFFs的细胞形态和活力产生了显著影响，且这种影响呈现出浓度依赖性。在24小时暴露后，随着电子烟液浓度的增加，细胞形态逐渐发生变化，包括细胞结构的破坏和细胞活力的下降。具体而言，0.25 mg/mL浓度的电子烟液已显示出细胞应激的迹象，而0.5 mg/mL浓度则导致细胞呈现异常的纺锤形和圆形形态，表明细胞骨架的破坏。在1 mg/mL的高浓度下，几乎所有的细胞均不可逆地死亡，这证实了电子烟液在高浓度下的强毒性。细胞活力的定量分析进一步支持了这些观察，显示随着浓度的增加，细胞存活率显著下降。LC??的计算结果为0.437 mg/mL，表明在此浓度下，50%的细胞群体会受到致命影响。这一结果为后续实验提供了关键的参考浓度。

在ROS检测方面，实验结果显示，电子烟液暴露显著增加了hVFFs细胞内的ROS水平，表明其诱导了氧化应激。这种ROS的增加可能与细胞内的炎症反应相关，尤其是在72小时的长期暴露后，ROS水平显著上升。相比之下，使用氢过氧化物（H?O?）作为阳性对照组，其ROS水平显著低于电子烟液暴露组，这提示电子烟液可能在某些条件下比H?O?具有更强的氧化效应。此外，qRT-PCR分析显示，TGFβ1和IL-8等促炎基因的表达水平在长期暴露后显著增加，进一步支持了电子烟液对hVFFs炎症反应的促进作用。这些结果表明，电子烟液暴露可能通过诱导ROS的生成和促炎基因的表达，导致hVFFs的炎症反应。

在胶原蛋白相关基因的表达分析中，研究发现电子烟液暴露对Col1A1和Col3A1的表达产生了动态变化。在短期暴露（24小时）中，Col1A1的表达显著下降，而Col3A1的表达则保持不变，这表明电子烟液可能对胶原蛋白I的合成产生抑制作用。与此同时，胶原酶活性在短期暴露后显著增加，表明细胞在早期阶段可能启动了胶原蛋白降解机制。然而，在长期暴露（72至96小时）后，这一趋势发生了逆转，Col1A1的表达增加，而胶原酶活性下降，这可能表明电子烟液暴露诱导了胶原蛋白的积累和降解能力的下降。这种胶原蛋白的动态变化可能反映了电子烟液对细胞外基质（ECM）的重塑作用，特别是在长期暴露下，可能促进了纤维化和炎症的进展。

电子烟液对HA的代谢也表现出显著的影响。在24小时暴露后，HA的分泌水平显著下降，而随着暴露时间的延长，HA的水平逐渐上升，特别是在96小时时达到显著增加（p < 0.01）。这种时间依赖性的HA变化可能与HA合成酶和降解相关基因的表达调控有关。研究发现，短期暴露显著降低了HAS1、HAS2和HAS3的表达，从而减少了HA的合成。而在长期暴露下，HAS1和HAS2的表达进一步被抑制，而HAS3的表达显著上升，这可能意味着HA的合成向低分子量HA转移，这与促炎反应相关。同时，CD44和HYAL2的表达在长期暴露下显著增加，表明HA的降解途径被激活，这可能导致HA的积累和促炎效应的增强。此外，通过CD44的沉默实验，研究者发现CD44的缺失可显著降低IL-8的表达，进一步确认了CD44在HA介导的炎症信号中的关键作用。

本研究还探讨了电子烟液暴露对胶原蛋白相关基因表达的影响。结果显示，短期暴露下，胶原蛋白I的表达显著减少，而胶原蛋白III的表达则没有明显变化，这可能表明电子烟液对胶原蛋白I的合成具有较强的抑制作用。然而，在长期暴露后，胶原蛋白I的表达显著增加，同时胶原蛋白降解受到抑制，这可能导致ECM的硬化和纤维化。这种胶原蛋白的动态变化可能反映了电子烟液暴露对ECM结构的重塑作用，特别是在长期暴露下，可能促进了纤维化和炎症的发展。

在探讨电子烟液对HA代谢的影响时，研究者还考虑了HA的分子量分布。由于HA的分子量对其生物学功能具有重要影响，因此其分布的变化可能对细胞功能产生深远影响。本研究中，HA的分泌水平在短期暴露后显著下降，但在长期暴露后逐渐上升，这种变化可能与HA合成酶和降解酶的表达变化有关。此外，HA的分子量分布也可能受到ROS和酶活性的影响，进而影响其在细胞外的生物学功能。

本研究的局限性在于，它主要依赖于未蒸发的电子烟液进行实验，而实际使用中，电子烟液会通过加热生成更多的有毒化合物。因此，未来的研究需要进一步考虑气溶胶生成的条件，并使用更接近真实情况的暴露模型，以全面评估电子烟液对声带的潜在危害。此外，研究中未检测HA的分子量分布，这可能影响对HA不同功能的区分。另外，使用的hVFF细胞系是通过hTERT转导实现永生化的，这可能改变内源性p53的活性，而p53是HAS2和HAS3表达的重要调控因子。因此，未来的实验应考虑使用原代hVFF细胞，以更准确地反映其在体内的反应。同时，研究还指出，声带中的hVFFs并非直接暴露于电子烟液或其气溶胶，而是通过上皮细胞的间接接触或跨细胞间隙的运输而受到影响。因此，进一步研究上皮细胞和免疫细胞在声带中的作用，可能有助于更全面地理解电子烟液对声带的影响。

综上所述，本研究揭示了电子烟液对hVFFs中HA代谢基因表达的影响，特别是在短期和长期暴露下的不同表现。这些发现为电子烟相关声带炎症的机制研究提供了新的视角，并为未来药物开发和生物标志物的识别奠定了基础。同时，研究也指出了当前实验方法的局限性，并建议未来研究应结合更复杂的暴露模型，以全面评估电子烟液对声带健康的潜在影响。