区分感染动物与接种疫苗的动物：NH-AGID检测方法在接种布鲁氏菌A19-?VirB12菌株的小母牛中的验证与应用

《Veterinary and Animal Science》：Differentiating Infected from Vaccinated Animals: Validation and Application of NH-AGID Assay in Heifers Immunized with Brucella abortus Strain A19-?VirB12

本研究评估了原生物素（NH）琼脂扩散免疫沉淀试验（NH-AGID）在区分接种A19-ΔVirB12疫苗的牛群中自然感染和疫苗接种的效果。实验采集30头接种牛的血清和阴道拭子样本，通过NH-AGID、竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）及PCR检测发现，NH-AGID特异性和阳性预测值均达100%，诊断准确率超90%，能有效区分感染牛与接种牛，支持布鲁氏菌病净化措施。

　　本研究旨在评估一种名为“原生半抗原凝胶免疫扩散法（NH-AGID）”的检测方法在区分接种A19-ΔVirB12疫苗的奶牛与自然感染的奶牛方面的有效性，并进一步识别细菌排泄的动物。通过实验分析，研究人员发现NH-AGID在诊断布鲁氏菌病方面表现出高特异性和较高的阳性预测值（PPV），且其对感染和排泄动物的诊断准确性超过90%。这一结果为布鲁氏菌病的防控提供了新的技术支持，尤其是在疫苗接种后的动物监测和疾病控制方面具有重要意义。

### 1. 研究背景与意义

布鲁氏菌病是一种人畜共患病，对公共健康和畜牧业构成了重大威胁。该病主要由布鲁氏菌属（*Brucella*）的不同种引起，包括*Brucella abortus*、*Brucella melitensis*等，这些细菌能够感染多种动物，如牛、羊、猪等，并通过多种途径传播给人类。根据现有文献，全球已有超过170个国家报告了人类布鲁氏菌病病例，且该病的流行趋势依然严峻。在中国，布鲁氏菌病的发病率也较高，2012年以来，每年平均报告的人类布鲁氏菌病病例超过3例/10万人，表明该病在畜牧业中仍具有较高的流行风险。

为有效控制布鲁氏菌病的传播，各国普遍采用疫苗接种和淘汰病畜作为主要防控措施。然而，传统疫苗如*Brucella abortus* S19、A19和*Brucella melitensis* Rev.1等虽然在预防疾病方面效果显著，但它们诱导的抗体可能会对血清学检测造成干扰，使得区分疫苗接种动物与自然感染动物变得困难。因此，开发一种能够有效区分疫苗接种与自然感染的检测方法成为研究的重点。

近年来，基因工程疫苗的发展为解决这一问题提供了新的思路。其中，A19-ΔVirB12疫苗是第一种专门针对牛的布鲁氏菌病基因工程疫苗，其通过删除*VirB12*基因，减少了疫苗与自然感染的交叉反应，提高了疫苗的特异性。尽管如此，现有的血清学检测方法如差异识别酶联免疫吸附测定（DI-ELISA）仍存在一定的非特异性反应，因此需要更高效、特异的检测手段来辅助诊断。

NH-AGID作为一种传统的血清学检测方法，因其高特异性而受到关注。该方法基于半抗原与抗体在凝胶中的扩散反应，形成可见的沉淀线，从而判断感染状态。研究发现，NH-AGID在检测布鲁氏菌病方面具有较高的准确性，尤其是在区分疫苗接种动物与自然感染动物方面表现出色。此外，NH-AGID还能有效识别细菌排泄的动物，这在布鲁氏菌病的防控中尤为重要，因为排泄动物是疾病传播的主要来源之一。

### 2. 实验设计与方法

本研究选取了一家具有流产史和布鲁氏菌病阳性检测记录的农场，对该农场的30头4至8月龄的母牛进行了A19-ΔVirB12疫苗接种。接种剂量为6×101? CFU，实验过程中按照预定时间间隔采集血清和阴道拭子样本。所有样本均按照GB/T 18646-2018标准进行初步筛查，采用玫瑰红染色试验（RBT）作为第一道检测方法，随后通过血清凝集试验（SAT）和竞争酶联免疫吸附测定（cELISA）进行确认。

在实验中，研究人员使用了多种检测手段来验证NH-AGID的诊断性能。这些方法包括RBT、SAT、cELISA、DI-ELISA（VirB12）以及NH-AGID。其中，DI-ELISA是基于内部开发的试剂盒，用于区分疫苗诱导的抗体与自然感染的抗体。而NH-AGID则由瑞尔威特生物科技公司提供，用于检测布鲁氏菌感染和排泄状态。此外，还通过AMOS-PCR和双重实时荧光定量PCR对阴道拭子样本进行分子层面的验证。

为了确保实验的科学性和可靠性，研究人员严格遵循伦理规范。所有动物实验均获得新疆畜牧兽医研究所动物伦理与福利委员会的批准，并在实验过程中遵循当地农业与农村事务部门的标准操作程序。实验过程中，动物的健康状况得到了充分考虑，所有样本采集均在动物自愿的前提下进行，确保了实验的伦理合规性。

### 3. 实验结果分析

在疫苗接种后的第15天，30头母牛的血清抗体阳性率达到了86.7%（26/30），平均SAT滴度为1:400。然而，随着时间推移，抗体阳性率逐渐下降，至接种后第180天时，仅剩6.7%（2/30）的母牛仍呈现阳性反应。这表明，A19-ΔVirB12疫苗诱导的抗体在体内具有一定的持续时间，但并非永久存在。抗体滴度在接种后第15天达到峰值，随后逐步下降，至第60天时平均滴度降至约1:200，之后基本维持在1:100以下。

进一步分析显示，NH-AGID在检测疫苗接种后的血清样本时表现出极高的特异性（100%）和阳性预测值（100%），其敏感性为85.71%，一致性率为92.8%。这表明，NH-AGID能够有效区分疫苗接种动物与自然感染动物，且其结果与SAT和cELISA具有高度一致性。同时，NH-AGID在识别排泄动物方面也展现出良好的性能，其对感染和排泄动物的诊断准确率超过90%。

对于40份通过PCR确认感染的血清样本，NH-AGID检测结果显示其中39份为阳性反应，仅1份为阴性。这表明NH-AGID在检测自然感染动物方面具有很高的灵敏度。而在检测疫苗接种动物时，NH-AGID的特异性同样保持在高水平，表明该方法在区分疫苗接种与自然感染方面具有显著优势。

此外，研究人员还对两头被DI-ELISA（VirB12）检测为感染的母牛进行了阴道拭子DNA提取，并通过AMOS-PCR和双重实时荧光定量PCR进行分子层面的验证。结果显示，仅有一份拭子样本在PCR检测中呈现阳性反应，其余样本均为阴性。这一结果可能与样本采集时间、细菌排泄的间歇性以及检测方法的敏感性有关。尽管如此，NH-AGID在这些样本中检测出了4份阳性反应，进一步支持了其在识别排泄动物方面的有效性。

### 4. 诊断方法的比较与优势

在比较不同诊断方法时，研究发现NH-AGID在检测疫苗接种动物时表现出较高的特异性，而其在检测自然感染动物时的敏感性稍逊于其他方法。然而，这一差异并不影响其作为辅助诊断工具的价值，因为NH-AGID的高特异性和PPV使其成为一种可靠的确认性检测方法。

相比之下，DI-ELISA（VirB12）在检测自然感染动物时表现出更高的敏感性，其在疫苗接种后第15天的检测结果能够更早地识别感染情况。然而，由于DI-ELISA的非特异性反应，其结果仍需结合其他检测手段进行验证。NH-AGID则因其高特异性，能够在后期更准确地区分疫苗接种与自然感染动物，为疾病防控提供了重要的技术支持。

在实际应用中，NH-AGID能够有效识别疫苗接种后的感染和排泄动物，从而帮助养殖场及时采取防控措施，防止疾病传播。例如，研究发现，在疫苗接种后的90天内，所有母牛的血清样本均未呈现NH-AGID阳性反应，这可能与A19-ΔVirB12疫苗的低致病性有关。因此，在接种后早期阶段，NH-AGID可能不如其他方法敏感，但在后期阶段，其检测结果更加可靠。

### 5. 实验结论与应用前景

综上所述，NH-AGID在布鲁氏菌病的诊断中展现出良好的性能，特别是在区分疫苗接种动物与自然感染动物方面。其高特异性和阳性预测值使其成为一种有效的辅助诊断工具，能够为养殖场提供更准确的疾病监测数据。此外，NH-AGID在识别排泄动物方面也具有较高的准确性，这在控制疾病传播方面尤为重要。

随着布鲁氏菌病防控工作的不断推进，疫苗接种和血清学检测的结合将成为重要的防控策略。NH-AGID作为一种传统的血清学检测方法，结合现代分子检测技术，能够为养殖场提供更全面的疾病诊断方案。未来，进一步优化NH-AGID的检测流程和提高其敏感性，将有助于其在更广泛的动物群体中推广应用。

在实际应用中，NH-AGID可以与其他检测方法如RBT、SAT、cELISA等结合使用，形成多级检测体系。这不仅能够提高诊断的准确性，还能减少误诊和漏诊的风险。此外，NH-AGID的检测结果可作为疫苗接种效果评估的重要依据，帮助兽医和研究人员更好地了解疫苗在动物体内的免疫反应情况。

### 6. 研究的局限性与未来方向

尽管本研究显示NH-AGID在布鲁氏菌病的诊断中具有较高的特异性和准确性，但其在早期阶段的敏感性仍存在一定的局限性。这可能与疫苗诱导的抗体在体内的持续时间有关，也可能与检测方法本身的灵敏度有关。因此，在实际应用中，需结合其他检测手段，尤其是在疫苗接种后的早期阶段，以提高诊断的全面性和可靠性。

此外，NH-AGID的检测结果可能受到多种因素的影响，如样本采集时间、细菌排泄的间歇性以及检测条件的稳定性。因此，在推广该方法时，需确保实验条件的一致性，并加强对检测人员的培训，以提高检测的准确性和可重复性。

未来的研究方向应包括优化NH-AGID的检测流程，提高其在早期阶段的敏感性，以及探索其与其他检测方法的协同作用。此外，还可以进一步研究NH-AGID在不同动物种类中的适用性，以确定其是否适用于更广泛的动物群体。同时，结合现代分子检测技术，如AMOS-PCR和双重实时荧光定量PCR，可以进一步提高诊断的准确性，为布鲁氏菌病的防控提供更全面的技术支持。

### 7. 对布鲁氏菌病防控的实际意义

布鲁氏菌病的防控不仅关系到畜牧业的健康发展，也对公共卫生安全具有重要影响。疫苗接种和血清学检测是当前防控的主要手段，但两者在实际应用中均存在一定的局限性。疫苗接种虽然能够有效预防疾病，但其诱导的抗体可能干扰血清学检测，使得区分疫苗接种与自然感染变得困难。而血清学检测虽然灵敏，但其结果可能受到多种因素的影响，导致误诊或漏诊。

NH-AGID作为一种结合传统血清学检测与分子检测的方法，能够有效解决上述问题。其高特异性和准确性使其成为一种可靠的辅助诊断工具，特别是在疫苗接种后的动物监测和疾病控制方面具有显著优势。通过NH-AGID，研究人员可以更准确地识别感染和排泄动物，从而采取针对性的防控措施，减少疾病传播的风险。

在实际应用中，NH-AGID可以用于养殖场的定期检测，帮助管理者及时发现感染和排泄动物，并采取相应的隔离和处理措施。此外，该方法还可以用于疫苗接种效果的评估，为疫苗的研发和改进提供科学依据。通过将NH-AGID与其他检测方法结合，可以构建一个更加完善的布鲁氏菌病诊断体系，提高防控工作的效率和效果。

总之，本研究为布鲁氏菌病的诊断和防控提供了新的思路和方法，NH-AGID作为一种高效的检测工具，有望在未来的动物健康监测和疾病控制中发挥重要作用。随着技术的不断进步和检测方法的优化，NH-AGID的应用前景将更加广阔。