基于G-四链体适体的生物传感器快速检测1型和2型单纯疱疹病毒

《Virology Journal》：Rapid detection of herpes simplex virus types 1 and 2 using a G-quadruplex aptamer-based biosensor

本研究针对HSV-1和HSV-2传统检测方法昂贵耗时的问题，开发了一种基于G-四链体适体AptNR88和纳米金颗粒的比色生物传感器。研究人员通过生物信息学工具设计特异性靶向gD糖蛋白的适体，实验验证其检测限达11.7 copies/mL（HSV-1）和15.7 copies/mL（HSV-2），为HSV快速诊断提供了新策略。

　　

在全球范围内，单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus, HSV）感染已成为重要的公共卫生问题。据统计，截至2020年，全球50岁以下人群中约有38亿人（64%）感染HSV-1（主要引起口腔疱疹），而15-49岁人群中约有5.2亿人（13%）感染HSV-2（主要引起生殖器疱疹）。这些病毒不仅引起皮肤黏膜病变，还可导致严重的并发症如脑炎和角膜炎，对人类健康构成持续威胁。

目前，HSV的实验室检测主要依赖实时荧光定量PCR（Real-time PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和细胞学检查等方法。虽然这些传统技术具有较高的准确性，但它们存在明显局限性：检测过程耗时较长，需要专业实验设备和熟练操作人员，成本较高，且难以在基层医疗机构或资源有限地区推广应用。因此，开发快速、简便、低成本的HSV检测新方法具有迫切需求。

适体（Aptamer）作为一种新型的分子识别元件，相比传统抗体具有独特优势。这些单链DNA或RNA分子能够通过形成特定的三维结构（如发夹、茎环、G-四链体等）高亲和力地结合靶标分子。特别是G-四链体适体，由于其特殊的四链结构，表现出更高的稳定性、易修饰性和强静电相互作用，在生物传感领域展示出巨大潜力。

在这项发表于《Virology Journal》的研究中，Nouri等研究人员创新性地将生物信息学预测与实验验证相结合，致力于开发一种基于G-四链体适体的比色生物传感器，用于HSV-1和HSV-2的快速检测。

研究人员采用多种关键技术方法开展研究：通过生物信息学工具（QGRS Mapper、RNAfold、Rosetta FARFAR）设计筛选G-四链体适体；利用分子对接（HDOCK、HADDOCK）分析适体与靶蛋白相互作用；合成30纳米纳米金颗粒并通过Turkevich法表征；优化适体浓度和盐诱导聚集条件；使用150例临床样本（来自伊朗伊斯法罕诊断实验室的女性宫颈分泌物，包括HSV-1、HSV-2感染样本及阴性、VZV、CMV对照）进行比色检测验证。

生物信息学设计与适体筛选

研究人员首先确定了HSV-1和HSV-2的gD糖蛋白作为理想检测靶点。该蛋白在病毒侵入过程中起关键作用，且在HSV-1和HSV-2间具有高度序列保守性，与其他疱疹病毒糖蛋白无显著同源性。通过多序列比对，他们确定了gD蛋白的162-257氨基酸区域作为适体结合的最佳靶区。

研究团队构建了包含300个随机序列的ssRNA库，利用QGRS Mapper筛选出120个G-四链体形成潜力评分高于60的序列。随后通过RNAfold预测二级结构，筛选出40个最小自由能（MFE）低于-40 kcal/mol的稳定结构。使用Rosetta FARFAR预测三级结构后，将RNA序列转换为DNA并优化能量。

分子对接结果显示，适体AptNR88与HSV-1 gD（PDB: 2C36、3W9E）和HSV-2 gD（PDB: 4MYV）均表现出优异结合能力，在HDOCK和HADDOCK服务器上获得最高评分（分别为-303.4、-285.2、-311和-110、-92、-114）。与人血清白蛋白（HSA）的低亲和力（-220和-50）证实了其特异性。相互作用分析显示AptNR88与gD间形成大量氢键和疏水相互作用，关键结合位点涉及精氨酸、赖氨酸等残基。

纳米金颗粒传感器的构建与优化

研究人员采用Turkevich法合成了平均尺寸为30纳米的纳米金颗粒（AuNPs），紫外-可见光谱在520纳米处显示特征吸收峰。动态光散射（DLS）和Zeta电位分析表明颗粒单分散性良好，表面电荷为-14.33毫伏。

通过盐耐受性实验确定300毫摩尔/升KCl为诱导纳米金聚集的最适浓度。优化后发现1微摩尔/升的AptNR88浓度能有效防止盐诱导聚集。傅里叶变换红外光谱（FTIR）证实适体通过氮原子和胺基与纳米金表面成功结合，适体包被后纳米金尺寸从29.54纳米增加至38.94纳米，Zeta电位变为-25.03毫伏，表明适体成功修饰。

检测性能与特异性评估

比色检测结果显示，当存在HSV-1或HSV-2时，AptNR88与gD蛋白结合，使适体从纳米金表面解离，加入KCl后溶液颜色由红变紫。该方法对HSV-1和HSV-2的检测限分别达到11.7拷贝/毫升和15.7拷贝/毫升，显著优于传统方法。

特异性实验中，阴性样本、水痘-带状疱疹病毒（VZV）和巨细胞病毒（CMV）样本均未引起颜色变化，证明AptNR88对HSV-1和HSV-2具有高度特异性。整个检测过程仅需15分钟，可实现肉眼判读，无需复杂仪器。

研究结论与意义

本研究成功开发了一种基于G-四链体适体的纳米金比色传感器，实现了HSV-1和HSV-2的快速、高灵敏检测。生物信息学指导的适体设计策略显著提高了筛选效率，AptNR88与gD蛋白的特异性结合为HSV检测提供了新思路。

该传感器的优势在于：检测限低至10¹拷贝/毫升级别，检测时间短（15分钟），操作简便（肉眼判读），成本低廉，且适用于资源有限 settings。相比实时荧光定量PCR和ELISA，该方法更符合床旁检测（Point-of-Care Testing, POCT）需求，在基层医疗机构和现场筛查中具有广泛应用前景。

此外，本研究建立的生物信息学辅助适体设计平台可推广至其他病原体检测领域，为快速诊断技术开发提供了新范式。未来通过优化适体序列和传感器构建，有望进一步提高了检测性能，实现多病毒联检，推动传染病快速诊断技术的发展。