基于单细胞RNA测序解析早产儿脓毒症中NK与T细胞的抗感染亚群作用机制

《European Journal of Medical Research》：Identifying the anti-infection NK and T cell subgroups in preterm newborns with sepsis using single-cell RNA-seq analysis

本研究针对早产儿晚发型脓毒症(LOS)免疫机制不清的临床难题，通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术分析早产新生儿外周血单个核细胞(PBMCs)，发现中性粒细胞免疫活性抑制而T细胞/NK细胞通过抗菌体液免疫反应和细胞氧化剂解毒等通路发挥关键抗感染作用，鉴定出GZMA+细胞毒性T细胞2、GRASP+T细胞、TMEM107+NK细胞和GPR171+NK细胞等具有潜在治疗价值的免疫亚群，其关键调控因子CREM、ETS1、HSPA5和STAT1可能成为改善脓毒症治疗的分子靶点，为早产儿LOS的免疫治疗策略开发提供了新视角。

　　

在全球范围内，早产儿脓毒症始终是威胁新生儿生命的重大临床挑战。特别是晚发型脓毒症(LOS)，作为发生在出生72小时后的水平传播感染，不仅导致极高的死亡率，更可能引发终身性 morbidity（发病率）、神经发育障碍等严重后遗症。尽管过去二十年中抗生素使用和产时筛查策略已显著降低脓毒症的风险和严重程度，但它仍然是新生儿死亡的主要原因之一。更令人担忧的是，存活下来的脓毒症患儿往往面临视觉损伤、精神运动指数和智力指数评分下降等长期并发症。

脓毒症的发病机制极为复杂。传统观点认为，脓毒症是先天免疫系统对病原体感染作出的异常强烈反应。当细菌脂多糖等病原体相关分子模式通过Toll样受体(TLRs)激活免疫细胞时，会触发肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-6(IL-6)等促炎细胞因子的释放，引发全身炎症反应。然而，早产新生儿的免疫系统与足月儿和成人存在显著差异：胎盘转移的母体IgG在妊娠中期开始，在晚期达到峰值，为婴儿提供被动保护，补偿其不成熟的适应性免疫力。这种免疫不成熟状态使得早产儿对感染更加易感，也使得脓毒症的治疗更加复杂。

目前，粒细胞输注、静脉注射免疫球蛋白(IVIG)等辅助疗法在脓毒症临床管理中效果有限，无法从根本上改善患儿预后。因此，深入探索早产儿脓毒症过程中各种免疫细胞的应答状态，对于开发新颖有效的干预策略至关重要。正是在这一背景下，Wang等研究人员在《European Journal of Medical Research》上发表了最新研究成果，通过单细胞转录组学技术揭示了早产儿LOS的免疫细胞图谱。

为了深入探究早产儿LOS的免疫机制，研究团队采用了多项关键技术：从Gene Expression Omnibus(GEO)数据库获取早产儿LOS的外周血单个核细胞(PBMCs)单细胞RNA测序数据(GSE236099)；使用Seurat和harmony R包进行scRNA-seq数据质控、标准化和批次校正；通过SingleR包和CellMarker 2.0数据库进行细胞类型注释；采用GSVA R包进行基因集富集分析(GSEA)；利用DAVID数据库进行差异表达基因功能注释；应用SCENIC工具进行转录调控网络分析。

识别参与抗感染反应的免疫细胞

通过单细胞聚类分析，研究团队成功识别出8个主要细胞簇，包括T辅助细胞、浆细胞B细胞1、CD8⁺T细胞、中性粒细胞、NK细胞、浆细胞B细胞2、红细胞和肥大细胞。细胞比例分析显示，脓毒症样本中T辅助细胞、中性粒细胞和NK细胞的比例分别比对照组高出2.15%、4.67%和1.36%，表明这些细胞可能是参与抗感染反应的主要免疫细胞。

中性粒细胞功能受损促进脓毒症进展

功能富集分析显示，脓毒症组中性粒细胞中核糖体和COVID-19通路富集，而正常组中性粒细胞则与糖酵解/糖异生、NF-κB信号通路、IL-17和趋化因子信号通路等免疫调节通路密切相关。正常组中PKM、PGK1、FBP1等糖酵解/糖异生通路基因，以及HSP90AA1、S100A9、IL1B、TNFAIP3等IL-17信号通路基因显著上调，而脓毒症组中这些基因表达下调，导致中性粒细胞免疫状态受损和抑制。

T细胞和NK细胞支持独特的抗感染反应

研究发现，T辅助细胞中抗菌肽介导的抗菌体液免疫反应、炎症反应中的白细胞迁移和防御反应等免疫通路在脓毒症样本中富集，RPL30、RPS19、HMGN2等相关基因表达上调。CD8⁺T细胞中抗菌肽介导的抗菌体液免疫反应、二氧化碳运输、细胞氧化剂解毒和过氧化氢分解代谢等通路在脓毒症样本中富集，MT2A、SOD2、PIM1等基因在应对有毒物质通路中上调。NK细胞中细胞解毒、过氧化氢代谢过程和氧化磷酸化等通路在脓毒症样本中富集，SOD1、GSTK1、TXN等细胞解毒相关基因表达上调。

GZMA+细胞毒性T细胞2和GRASP+T细胞是关键抗感染亚群

T辅助细胞被细分为6个亚群，其中只有GZMA+细胞毒性T细胞2在脓毒症组中比例更高。该亚群富集了细胞对肿瘤坏死因子的反应、细胞增殖调控、NIK/NF-κB信号传导和细胞对糖皮质激素刺激的反应等免疫相关通路。CD8⁺T细胞被分为2个亚群，GRASP+T细胞在脓毒症组中比例更高，其富集的激活免疫通路包括炎症反应、I-κB激酶/NF-κB信号的正向调控以及细胞对肿瘤坏死因子的反应。

TMEM107+和GPR171+NK细胞是重要抗感染NK亚群

NK细胞被细分为5个亚群，其中TMEM107+NK细胞和GPR171+NK细胞在脓毒症组中比例升高。TMEM107+NK细胞富集了细胞增殖的正向调控、T细胞受体信号和免疫反应通路以及αβT细胞激活通路，而GPR171+NK细胞则富集了炎症反应、细胞周期调控和细胞对肿瘤坏死因子反应等通路。

CREM、ETS1、HSPA5和STAT1是介导抗感染反应的关键调控因子

SCENIC分析发现，CREM、ETS1、FOXP1、JUND、HSPA5和STAT1是GZMA+细胞毒性T细胞2中的关键调控因子；ETS1和STAT1是TMEM107+NK细胞中的关键调控因子；CEBPD、ETS1、CREM、HSPA5和STAT1是GRASP+T细胞中的关键调控因子；CEBPD、CREM、HSPA5和RUNX3是GPR171+NK细胞中的关键调控因子。值得注意的是，CREM、ETS1、HSPA5和STAT1在多个细胞簇中均表现为显著调控因子，表明它们可能通过调节抗感染相关免疫基因的表达来影响早产儿脓毒症的整体免疫微环境。

该研究通过单细胞转录组学构建了早产儿LOS的免疫图谱，揭示了中性粒细胞功能受损与T/NK细胞代偿性激活的免疫失衡特征。研究不仅识别了具有抗菌/氧化应激程序的关键免疫亚群，还发现了CREM、ETS1、HSPA5和STAT1等潜在治疗靶点。这些发现为理解早产儿LOS的免疫病理机制提供了新见解，为开发靶向免疫治疗策略和个体化预后评估奠定了理论基础。尽管研究存在样本量小、缺乏功能验证等局限性，但其建立的单细胞免疫图谱和识别的重要生物标志物，为后续大规模临床研究和机制探索指明了方向，对改善早产儿脓毒症的治疗效果具有重要指导意义。