TRAMbio：基于图刚性分析与卵石游戏算法的生物大分子柔性分析新工具

《BMC Bioinformatics》：TRAMbio : a flexible python package for graph rigidity analysis of macromolecules

本研究针对生物大分子三维结构刚性分析缺乏易用工具的问题，开发了基于Python的TRAMbio软件包。该工具通过实现(k,l)-稀疏图的卵石游戏算法，能够高效识别蛋白质等生物大分子的刚性组件，为研究蛋白质功能区域识别、构象变化追踪和模拟展开等关键问题提供了新方法。研究证明TRAMbio在处理大分子和蛋白质运动时间序列时表现优异，结果可通过标准分子可视化平台呈现，对生物信息学和结构生物学研究具有重要意义。

　　

在生命科学领域，蛋白质作为细胞干物质的主要组成部分，调控着绝大多数细胞功能的关键过程。它们催化细胞代谢中的化学反应，作为生物大分子产生和降解的调节剂，响应环境信号发挥控制作用，并协调多细胞生物的发育过程。因此，由突变、化学修饰或病原体引发的蛋白质结构改变，常常通过改变结合界面和破坏调控网络相互作用，成为疾病的分子根源。

由于蛋白质功能由其与环境的物理和化学相互作用定义，准确表示其三维结构是理解其生物学作用的关键第一步。虽然核磁共振(NMR)、低温电子显微镜(cryo-EM)和X射线晶体学等实验技术已能确定蛋白质的单体三维结构，但构象变化作为蛋白质功能机制的重要组成部分，却难以通过实验捕捉。尽管NMR原则上可以测量蛋白质动力学，但计算方法通常更为便捷和广泛应用。分子动力学(MD)最常用于模拟基于描述分子内和分子间化学键以及静电和其他相互作用的势能的单个原子运动。

MD模拟的一个缺点是原子级分辨率使得识别结构非局部变化背后的力学机制变得非平凡。这在变构效应中尤为重要，其中一个位点的结合事件会影响不同的功能位点。在此类应用中，识别相对于彼此集体运动的子结构特别受关注。

刚性分析是识别此类块的有前景的计算策略。为此，在较长时间尺度上基本保持不变的原子间距离被解释为图的边。然后在纯图论水平上定义刚性组件，这些组件不允许内部运动，但保持彼此相对的残余自由度。刚性分析在蛋白质科学中的普遍有用性已在多个研究中得到证明。

高效的组合算法基于所谓的卵石游戏。尽管已有实际实现可用，如ProFlex/FIRST、ASU和KINARI，但目前似乎没有易于使用的分子刚性分析开源工具。本研究旨在填补这一空白。

TRAMbio实现了经典的刚性卵石游戏算法，同时提供了一个面向蛋白质分析的便捷框架，包括与蛋白质数据库的直接接口。尽管专注于蛋白质结构，TRAMbio在其核心实现了一类通用的卵石游戏算法，处理所谓的(k,l)-稀疏图，这包含了最重要的图刚性概念。因此，TRAMbio可用于解决独立于特定应用领域的组合刚性问题。

本研究的主要技术方法包括：基于(k,l)-稀疏图理论的卵石游戏算法实现，专门针对分子刚性分析优化了(6,6)-卵石游戏；开发了从PDB文件自动提取共价键、氢键和其他分子相互作用的算法；实现了针对分子动力学轨迹的时间序列分析功能；采用了分阶段卵石游戏策略预构建共价键结构以提高计算效率。

分子表示与图构建

分子通常具有明确的键长和键角，后者意味着次近邻也具有固定的、明确确定的距离。从分子图M=(V,B)开始，其中顶点代表原子，边代表化学键，固定距离在第二个图G=(V,E)中编码，每当存在z∈V使得xz∈B和zy∈B时，xy∈E。因此，描述原子上所有刚性距离的图G是M的平方。原子V通过映射η:V→R^D嵌入D维欧几里得空间，对于分子而言D=3。图G与映射η以及所有xy∈E的长度函数?(xy):=‖η(x)-η(y)‖一起称为框架。欧几里得距离矩阵D_xy:=‖η(x)-η(y)‖自然与框架关联，使得所有xy∈E有D_xy=?(xy)。如果框架的距离矩阵D由边长度?唯一定义，则框架(G,η)是全局刚性的。

无穷小运动v由每个x∈V的D维速度向量v_x组成，使得所有xy∈E有(v_x-v_y)(η(x)-η(y))=0。该线性系统可以重写为R_ηv=0的形式，其中v是D|V|维速度向量，R_η是|E|×D|V|维刚性矩阵。R_η的每一行对应图G的一条边xy，其中包含顶点x的速度的v_x-v_y，顶点y的速度的v_y-v_x，否则为0。如果框架(G,η)是无穷小刚性的，则仅存在"平凡"运动v，不影响任何两个顶点之间的距离，即如果R_η的秩等于D|V|-binom(D+1,2)。binom(D+1,2)个平凡自由度对应于D维空间中刚体的平移、旋转和一般螺旋运动。R_η的秩通常明确依赖于η。然而，如果图G具有无穷小刚性框架(G,η)，则其所有通用框架(即坐标在有理数上代数独立的嵌入框架)都是无穷小刚性的。因此，通用无穷小刚性仅是图G的性质。

对于二维情况，棒棒连接框架的通用刚性由Geiringer-Laman定理表征：G=(V,E)作为二维棒棒连接框架是通用刚性的，当且仅当它包含一个生成子图G'=(V,E')，满足|E'|=2|V|-3，并且对于所有边子集F?E'，有|F|≤2|V(F)|-3，其中V(F)是与F关联的顶点集。对于三维的类似计数公式(根据麦克斯韦理论，|E'|=3|V|-6且|F|≤3|V(F)|-6)由于著名的"双香蕉"图而失败。

如前所述，分子自然建模为结构式平方的棒棒连接框架。或者，每个原子及其邻居可以被视为通过铰链连接的刚体，铰链对应于连接键，通常允许自由旋转。然而，这些分子体铰链框架具有称为铰链共点的特殊配置，因为入射到体的所有铰链(化学键)在体中心的原子处相交。这种特殊配置原则上可能通过引入额外的线性依赖性来改变(无穷小)自由度。三维铰链共点体铰链框架的刚性等价于相应刚性板铰链框架的刚性。1984年，Tay和Whiteley猜想，在任意维度中，多重图G可以实现为无穷小刚性体铰链框架，当且仅当G可以通过无穷小刚性板铰链框架实现。这个所谓的"分子猜想"由Jackson和Jordan在二维情况下证明，最终由Katoh和Tanigawa在任意维度证明。因此，测试分子图的体铰链刚性足以确定分子图平方的棒棒连接刚性，从而确定分子的刚性。

如果框架是刚性的，并且删除任何边会导致柔性(即非刚性)框架，则该框架是最小刚性的。几种不同类型的图通用刚性由自由度计数表征，这导致了类似于二维棒棒连接框架的组合条件。数学基础方便地用所谓的(k,l)-稀疏图表示，其中k>0且0≤l<2k。这类图在拟阵理论背景下引入：

定义1：如果对于所有非空E'?E有|E'|≤k|V(E')|-l，则多重图G=(V,E)是(k,l)-稀疏的。如果它是(k,l)-稀疏的且|E|=k|V|-l，则是(k,l)-紧的。

因此，(k,l)-紧图对应于相应刚性概念的最小刚性图。也就是说，如果图包含一个生成(k,l)-紧子图，即它是(k,l)-稀疏的，则该图是"(k,l)-刚性的"。

定义2：(k,l)-刚性组件是G的顶点最大子图，该子图是(k,l)-紧的。

两个(k,l)-刚性组件总是边不相交的。对于0<>0，所有(k,l)-刚性组件都是连通子图。对于l=0的特殊情况，给定图中仅存在单个(k,l)-刚性组件。

卵石游戏算法

卵石游戏是在一组V节点上进行的单人游戏，每个节点初始化为k个卵石。玩家在顶点之间插入和定向边。特定卵石游戏的规则确定接受边的条件、何时可以移动卵石以及重新定向边。卵石游戏算法通过尝试以任意顺序插入给定图G的边来"玩"卵石游戏。Jacobs和Hendrickson提出了一种简单的卵石游戏算法来判断平面棒棒连接刚性，即识别Laman图。这一思想在(k,l)-图的背景下得到推广：

从无边图D开始，如果两个顶点u和v共同包含至少l+1个卵石，则将输入图G的边e插入D中u和v两个节点之间。此外，任何单个顶点不允许超过k个卵石。否则，可以从可从u或v到达的任何顶点w连续检索额外的卵石。将卵石从w运输到u或v会反转从u到w或从v到w的单个有向路径上所有边的方向。边被定向为u→v，并且移除u中的卵石，除非u上没有卵石，在这种情况下颠倒u和v的角色。如果在尝试插入所有输入边后D恰好包含l个卵石，则如果所有边都成功插入，则G是(k,l)-紧的，否则它包含冗余边。

通过此过程的简单扩展可以检测刚性组件，该扩展明确维护刚性组件。在尝试插入边e=uv时，检查u和v是否在同一组件中，在这种情况下边是冗余的。否则，如果e可以插入，则检查是否形成新组件，或者附加边是否导致两个或多个组件连接。

分子结构的表示

对于分子结构，因此可以通过在分子体铰链框架基础的多重图上玩(6,6)-卵石游戏来解决刚性问每个分子单键在体铰链图中被编码为同一对原子之间的5条边，留下一个由扭转角给出的单一自由度。另一方面，双键是刚性的，并将入射原子的邻域约束到一个共同的平面上。这种附加约束在多重图中表示为第6条边。三键类似处理。

由于卵石游戏的结果是该"分子多重图"中(k,l)-紧子图的列表，其中每个节点代表一个由中心原子及其最近邻组成的刚体，因此需要将这些结果映射回分子图上。一个原子可能是多个刚性组件的一部分，因为它可能既是一个刚体的中心，又是以其每个相邻原子为中心的一个或多个刚体的外围部分。任何价数为1的原子，例如氢和卤素，也可以被认为与其唯一的结合伙伴形成一个刚体。然而，这些完全包含在相邻体中，因此可以忽略。

在蛋白质结构的应用中，只有考虑氢键和其他接触，才能预期有趣的结果。否则，至少沿着主链的N-C和C-C之间的扭转角仍然不受约束，并且除了单个氨基酸的部分之外，没有"有趣"的刚性组件。氢键由于其明确的键长和键角，自然像单共价键一样处理。

在刚性分析中表示附加的较弱非共价相互作用要直接得多。这特别涉及疏水束缚以及弱氢键。一种可能性是用少于五条边表示此类接触，特别是在通用体杆框架中，这将直接关系到相应体之间的较少约束，从而表示整个系统中更多的灵活性。然而，关于分子建模，通过入射到体的化学键的交点可能会出现进一步的线性依赖性。除了前面提到的铰链共点之外，该模型还允许两条杆或一条杆和一个铰链的交点，分别称为杆-杆共点和杆-铰链共点。虽然"分子猜想"意味着铰链共点不影响刚性结果，但杆-杆或杆-铰链共点没有类似的结果存在。此外，使用特定边来表示此类接触应被视为启发式近似。

TRAMbio软件包

TRAMbio(分子生物学中的拓扑刚性分析)是一个基于卵石游戏并以卵石游戏为核心的纯Python包。它提供了图论中通用应用的功能，包括测试(k,l)-稀疏性以及确定(k,l)-生成子图，即(k,l)-刚性组件。关于分子数据，特别是蛋白质，TRAMbio提供了在原子或残基水平上进行刚性分析的工具，并具有针对 specialized 任务的进一步功能，例如(a)单状态蛋白质数据上的模拟蛋白质展开和(b)分子动力学轨迹中刚性组件变化的时间跟踪。

输入数据

TRAMbio处理GraphML格式的通用图数据，并提供与PDB和XTC数据的便捷接口，以研究蛋白质结构中的刚性。

PDB文件格式是1972年引入的基于文本的格式，用于在蛋白质数据库(此类数据的主要社区资源)中存储三维蛋白质结构。截至撰写本文时，PDB为蛋白质提供了229,681个高质量结构，以及更多的计算结果。PDB数据记录原子坐标。共价键、氢键和其他相互作用没有明确给出，因此需要从原子的相对位置推断。TRAMbio实现了提取图结构的算法，遵循既定的程序：(a)首先使用氨基酸模板确定共价相互作用，如KINARI"分阶段卵石游戏"的初始步骤，然后采用通用的基于距离的算法处理遗漏的边，这与graphein中使用的方法基本相同。(b)氢键和盐桥按照描述确定。(c)使用基于范德华表面的距离方法或利用Lennard-Jones-12-6势的KINARI描述的基于势的算法计算疏水相互作用。(d)使用https://getcontacts.github.io/interactions.html列出的几何参数计算其余非共价相互作用(例如π-阳离子或π堆叠)。分子图构建过程的更多细节见附录A。

分子动力学轨迹描述了分子三维构象的时间演化。XTC文件格式将轨迹编码为原子三维坐标的时间序列，基于Unix的外部数据表示概念。使用MDAnalysis或mdtraj加载轨迹后，每个选定帧的坐标作为PDB数据导出，并且如上所述计算原子之间的相互作用。由于所有帧模拟处于各种状态的相同蛋白质，因此只需确定一次共价键，然后假设所有帧都存在，而非共价相互作用则针对每个帧单独计算。

工具描述与架构

TRAMbio的架构由两个主要部分组成。其核心是一个用于任意k和l的通用(k,l)-组件卵石游戏的API，以及分子刚性计算背景下的特定(6,6)-卵石游戏。

工作流结构遵循SOA(面向服务的架构)设计模式，为卵石游戏API实现便捷的接口。尽管SOA最常与Web应用程序相关联，但对于由分布式但集成的组件组成的软件系统来说，它是有用的设计基础。就TRAMbio而言，除了能够直接从蛋白质数据库下载蛋白质信息外，工具的其余部分，尤其是整个计算，完全在本地运行。SOA的使用将TRAMbio的程序逻辑分离到用于处理I/O、内部结构、分子相互作用建模和整体工作流的专用注册表中。尽管Python没有本机接口结构，但抽象类的使用允许重新创建接口功能。

内部数据结构和卵石游戏的实现高度利用Python包NetworkX和BioPandas。蛋白质的输入数据以PDB格式通过数据帧存储和处理。除此之外，最著名的内部结构是(1)原子水平上的蛋白质图表示，具有检测到的共价和非共价键作为带注释的边，以及(2)在卵石游戏期间用作辅助图的加权双向有向图。与多重图相比，加权有向图被利用，基于整体性能提高，因为边反转(单个边的移除和重新添加)在实践中减少为更省时的权重转移。这一概念已在KINARI-2中应用。

基于XML设计了一种用于存储分子刚性或通用卵石游戏结果的自定义文件格式。为两种结构类型提供了XML模式以保证文件完整性。由于卵石游戏采用全原子模型进行刚性计算，因此提供了附加功能以将结果转换为残基水平刚性组件。由于其复杂性降低，这些输出格式为JSON。

功能、特性和实现

本小节概述了TRAMbio的工作流，包括通用工作流以及特别针对单状态蛋白质和分子动力学模拟轨迹应用的工作流。它还重点介绍了关键特性和底层实现细节。TRAMbio特别在开源框架中重新实现了ASU FIRST和KINARI的一些功能，该框架设计为易于维护和扩展。

除了提到的面向服务的API外，TRAMbio是一个仅限命令行的工具，具有五个独立的工作流。

利用生物聚合物(如DNA、RNA以及本例中的蛋白质)的已知共价结构，对应于共价键的大部分边插入可以在运行卵石游戏之前确定。 thereby，从蛋白质图中提取一个反向树形图，其中每个节点最多有l-1条边指向外。这代表了卵石游戏的一个明确定义的状态。这种方法由Bygi和Streinu首次引入，称为"分阶段卵石游戏"，大大减少了所需的计算时间，因为只有剩余的边需要通过实际的卵石游戏运行来测试。为了进一步加速计算，对轨迹上的状态卵石游戏运行以及将结果映射到刚性分子结构采用了多处理方法。

构建纯Python包的一个主要设计后果涉及分子的力学建模，特别是非共价相互作用的计算。这排除了使用第三方软件来外包模型复杂性。现有Python包graphein用于分子图建模的现成解决方案在开发期间曾被暂时考虑。然而，我们意识到其纯基于距离的相互作用模型过于局限。当前版本的graphein确定氢键如下：首先，使用每个残基原子类型的一组预定规则将分子的所有原子过滤成一组供体和受体原子。然后，该集合中的所有原子对(不限于供体-受体对)如果最多相距3.5 ?(如果该对包含硫原子，则为4.0 ?)，则认为通过氢键连接。相比之下，ASU FIRST使用几何标准和Mayo势来建模氢键。由于这种方法似乎更适合我们的要求，我们直接在TRAMbio内实现了这种相互作用模型。这一决定加上SOA结构模式提供了高度的灵活性，因为每个相互作用都通过其自己的参数化服务进行隔离，并且可以通过引入附加服务来扩展分子相互作用模型。

蛋白质展开可以理解为响应温度升高而断裂弱相互作用。(k,l)-稀疏图的拟阵性质确保了边的插入顺序是任意的。因此，只需将非共价键从最强到最弱排序，并记录此插入顺序每一步的刚性组件。因此，蛋白质展开可以在卵石游戏的单次运行中模拟，考虑反向插入顺序中刚性组件的溶解。

如前所述，当前版本的TRAMbio是一个仅限命令行的工具，不提供自己的图形可视化功能。相反，它有一个单独的工作流用于创建带注释的、与PyMol兼容的文件。下面显示的应用示例就是以这种方式生成的。TRAMbio使用一致的着色算法，类似于提出的算法，以允许在时间上(对于轨迹)或在稀释期间(对于单个状态)视觉跟踪刚性结构的发展。

应用

在本节中，我们总结了TRAMbio在通用图以及选定蛋白质上的运行时性能，并解释了示例性稀释分析结果的可视化。

对于通用图的基准测试，生成了随机Laman图和遵循经典Erdos-Renyi模型的具有2种不同边概率的随机图，以及一组具有不同节点大小的完全图。使用tram-pebble模式运行TRAMbio。结果总结在表3中。

对于小图，运行时间主要由计算开销(如I/O操作)决定，而不是卵石游戏算法。对于较大的图，总运行时间似乎与边数接近线性比例。虽然卵石游戏本身具有O(n²)的运行时复杂性，但很容易观察到卵石游戏可以在路径图上以O(n)进行。因此，对于任意图，我们在每个图组件中获得一个因子n，其中路径充当"主干"。第二个因子n源自该路径分支的结构。然而，我们通常预期只有数量m<<>

尽管TRAMbio已经具有使用并行化的卵石游戏变体，但表3中的所有图都使用单核处理分析一次，以便更容易比较运行时间。由于插入边的顺序对检测到的组件没有影响，理论上可以将图分离为不相连的子图和一组连接边，在这些子图上(并行)运行卵石游戏，组合它们得到的卵石图，最后为连接边玩卵石游戏。由于卵石游戏已经具有近线性性能，拆分和重新组合相应图相关的计算开销在较小的图上似乎令人望而却步，导致几乎相同的实时性能。然而，对于足够多的边，多处理可以显著减少计算时间。通用情况图的有效多处理的使用案例和大小阈值尚待确定。截至目前，这些功能仍被视为实验性的。

对真实数据集的基准测试是在公开可用的蛋白质数据上进行的，利用了TRAMbio的两种不同模式。对六个不同的蛋白质PDB使用tram-pdb进行了刚性分析，并对单个蛋白质相互作用以两种不同的时间分辨率使用tram-xtc进行了轨迹分析。运行时间总结在表4中。PDB数据是在执行前从蛋白质数据库下载的，并使用软件Reduce添加缺失的氢原子。基准测试不包括两者的时间。轨迹分析允许并行化，因为帧可以很大程度上相互独立地计算。β2-肾上腺素能受体的轨迹数据以50的步幅(仅使用每第50帧)分析一次，并在整个轨迹上分析一次。所有运行均使用默认运行选项执行，主要包括识别所有可能的非共价相互作用，如第3.1节所述。

与通用图相比，在相同数量的原子/节点上，运行时间平均要长一个显著因子。同时，运行时间更明显地偏离线性复杂性，显示出卵石游戏理论二次项的更高影响。我们推测这两种效应都是由于tram-pdb的经典卵石游戏算法扩展了稀释分析。稀释分析构成了蛋白质分析的一个组成部分，如下文即将阐明的那样，为后处理提供有价值的数据。因此，它被深度集成到算法中，每次组件因插入氢键(或其他量化的非共价相互作用)而发生变化时，都会创建卵石游戏状态解释的快照。

与原始卵石游戏相比，此附加步骤的运行成本大大超过。相比之下，用于轨迹分析的TRAMbio模式tram-xtc不包括稀释分析，导致具有16,646个原子的单帧运行时间约为22-36秒(参见表4)，这比在可比大小的PDB上进行稀释分析要快得多。

最初，考虑将稀释分析作为可选功能，默认情况下运行无稀释的刚性分析。然而，这给研究人员带来了显著的用户体验问题。在典型设置中，用户必须提供能量阈值，直至该键强的氢键应被考虑，从而定义相关键的集合，严重影响刚性组件。然而，考虑到TRAMbio中用于模拟氢键强度的能量函数，很难推导出精确的局部键能(或相应的系统温度)。因此，实际插入的氢键集合可能与用户期望不同。如果稀释数据可用，则对阈值的调整很容易确定，否则需要完全重新运行卵石游戏。

尝试对具有超过80,000个原子的蛋白质进行额外的基准测试运行。然而，通过BioPandas加载PDB数据的初始步骤需要指数级的内存量(超过200 GB)，远远超过了普通研究计算机甚至计算服务器的限制。这凸显了我们方法的一个重要局限性。值得注意的是，对于轨迹分析，非共价相互作用检测和卵石游戏稳定性分析的基于帧的并行化使得整体计算速度提高了约13倍。

如前所述，TRAMbio目前依赖3D分子可视化工具PyMol进行蛋白质分析结果的外部可视化。作为一个例子，图6显示了新蛋白质Trp-Cage小蛋白构建体TC5b四个独立稀释步骤的可视化。

为了更好突出剩余的、更复杂的组件，琐碎组件(即每个原子仅与其直接共价邻域)不被可视化。没有任何氢键时，蛋白质分解为许多小刚性单元(参见图6a)。引入更多氢键会增加整体刚性，直到蛋白质的大部分形成单个刚体(参见图6d)。剩余的非平凡刚性结构主要对应于外围肽单元。

我们的主要焦点是卵石游戏在蛋白质分析中的应用。然而，卵石游戏以及TRAMbio的应用不仅限于蛋白质，分析工作流可以应用于各种不同的分子，最明显的是DNA和RNA。为确保这种兼容性，自动测试管道运行的验证实验包括检测DNA或RNA核苷酸之间的特征性氢键，以及检测RNA结构中的π堆叠相互作用。刚性分析在DNA上的示例应用，特别是16碱基对B-DNA(PDB代码3BSE)，可见图8。

为了证明基于刚性的社区分析对大型复杂蛋白质的适用性，我们使用β2-肾上腺素能受体(β2AR)作为示例，参见图9。多结构域G蛋白偶联受体β2AR包含刚性跨膜区域和柔性环。图9说明了在MD模拟的六个连续帧上刚性氨基酸社区的演变，以1 ns间隔采样。每个社区由 distinct 颜色表示，允许直接可视化底层刚性模式的动态变化。结果揭示了社区的时间重组，在跨膜螺旋和细胞内环上发生合并和分裂事件。这种变化反映了结构刚性和柔性的局部适应，这些不易通过传统的二级结构或均方根偏差分析捕获。重要的是，基于刚性的社区分析能够突出相对稳定的跨膜结构域和更无序区域之间的相互作用，从而提供结构稳定性的结构域水平视角，同时捕获瞬态重新配置。此示例演示了基于刚性的社区分析如何超越小型测试蛋白质，扩展到大型、多结构域膜受体。通过跟踪社区组织随时间的变化，该方法提供了对构象转变和结构区域之间动态耦合的机制见解，这对受体激活和信号转导至关重要。

结论与展望

TRAMbio是一个(纯)Python包，实现了(k,l)-稀疏图的卵石游戏，以及面向通用图分析和蛋白质刚性简便分析的包装函数。由于缺乏其他可访问的软件，TRAMbio的开源框架填补了当前围绕卵石游戏的可用刚性软件的空白。因此，我们的工具将有助于研究人员在蛋白质稳定性和运动相关的广泛应用中，例如表征蛋白质中的运动机制或模拟展开。此外，如图中所示，图刚性结果可用于分子动力学的预处理。由于这些更快的启发式方法可以识别完全刚性的原子社区以及它们之间的运动潜力，刚性结果允许更紧凑的蛋白质建模，进而降低更复杂的、基于几何的蛋白质模拟的成本。我们的基准测试突出了相对较低的计算成本，即使对于非常大的蛋白质和时间序列也是如此。已经实现的并行化可用于进一步加速计算。更深入的并行化策略可能在未来的更新中实现，但需要进一步研究。尽管稀释分析显著减慢了蛋白质的计算时间，但它们对于确定正确的能量阈值至关重要，从而避免成本更高的重新运行。

TRAMbio的未来发展将特别侧重于为蛋白质分析定制图形用户界面，并直接集成用于刚性结果的分子可视化器。这将简化各种用例，例如稀释实验参数的微调。另一个重点任务是额外支持分析变构效应和检测分子图中的对称性，这可能导致灵活性增加。这对小分子和蛋白质复合物都很有意义。集成用于定义自定义相互作用和能量函数的编程接口将使研究人员能够更好地根据其研究任务的具体需求微调力学建模。

附录A：图构建

以下段落详细阐述了TRAMbio中分子图的构建过程。

共价边

与KINARI类似，大多数共价键通过每个残基的模板放置，因为氨基酸和核苷酸的结构是先验已知的。这些模板假设标准/非简并氨基酸或核苷酸，主链建模为从氮末端(N)到碳末端(C)的直有向图(对于氨基酸)，其中主链氧(O)单独连接到，以及从主链磷原子(P)到3'-氧(O3')的有向图(对于核苷酸)。环状结构，如核糖，在预设键处断裂，稍后在卵石游戏中重新连接。侧链被建模为指向各自主链α碳(CA)或1'-碳(C1')根的有向树。氨基酸、肽和核苷酸中的原子名称使用IUPAC和IUBMB命名法指定。

两个氨基酸之间的肽键可以从PDB数据中的序列距离识别(前提是两个氨基酸位于同一链上)。然后双重检查各自主链氮(N)和碳(C)之间的共价距离是否落在肽键范围内。DNA或RNA残基之间的磷酸二酯键的计算类似，使用主链磷原子(P)和3'-氧(O3')。使用[60]和[61]中通过原子类别指定的标准共价半径进行检查，这些也用于