CRISPR/Cas9技术揭示TBPL1基因在乳腺癌细胞中的转录调控新机制及分子标志物发现

《Scientific Reports》：RNA-seq analysis of wild-type and mutated TBPL1 gene in breast cancer cells lines through CRISPR/Cas9 approach reveals novel molecular signatures

本研究针对乳腺癌中转录调控机制尚不明确的问题，通过CRISPR/Cas9技术敲除TBPL1基因，结合RNA-seq分析野生型与突变型乳腺癌细胞系的转录组差异。研究发现TBPL1通过调控细胞迁移、增殖、抗凋亡相关基因（如LAMC2、KRT6A、VIM等）影响乳腺癌进展，并首次发现多个新型IncRNAs参与该过程。该研究为理解TBP家族成员在癌症中的特异性功能提供了新视角，为乳腺癌靶向治疗开发提供了潜在分子靶点。

　　

乳腺癌是全球女性癌症相关死亡的主要原因，其发生发展与基因转录水平的异常调控密切相关。在真核生物中，RNA聚合酶II（RNAP II）负责转录所有蛋白质编码基因，而转录起始需要TATA框结合蛋白（TBP）及其相关因子组成的复合物参与。TBP家族包括TBP、TBPL1和TBPL2三个成员，其中TBPL1作为TBP的远缘旁系同源物，仅与TBP核心域有40%的相似性，且不能直接结合TATA框。既往研究表明，TBPL1在结直肠癌中通过调控miR-18a表达影响肿瘤进展，但其在乳腺癌中的作用尚不明确。

为了解决这一问题，研究人员在《Scientific Reports》上发表了最新研究，通过CRISPR/Cas9技术敲除TBPL1基因，结合RNA-seq技术系统分析了野生型与突变型乳腺癌细胞系的转录组差异，揭示了TBPL1在乳腺癌中的新型分子调控网络。

本研究主要采用以下关键技术方法：首先利用CRISPR/Cas9系统构建TBPL1基因敲除的乳腺癌细胞系（包括MCF-12F健康细胞及T47D、SK-BR-3、MDA-MB-231癌细胞），通过RT-PCR、Western blot和免疫荧光验证敲除效率；随后对24个样本（野生型与突变型各3重复）进行RNA-seq测序，使用Trimmomatic质控、STAR比对和RSEM量化基因表达，并通过聚类分析和KEGG富集分析筛选差异表达基因与通路；最后通过MTT实验评估基因敲除对细胞活力的影响。

TBP和TBPL1基因在不同乳腺癌细胞系中呈现差异表达模式

研究人员首先通过RT-PCR和RT-qPCR检测了TBP家族基因在多种乳腺癌细胞系中的表达情况。结果显示，TBP和TBPL1在所有细胞系中均有表达，而TBPL2未检测到表达。进一步定量分析发现，TBP在侵袭性较强的SK-BR-3（HER2过表达）和MDA-MB-231（三阴性）细胞中表达显著上调，分别达到健康细胞系的400%和750%。TBPL1的表达模式与TBP相似，在SK-BR-3和MDA-MB-231中分别上调90%和120%，表明这两个基因的表达水平与乳腺癌的分子分型和侵袭性相关。

TBPL1基因在乳腺癌细胞系中的沉默效果验证

通过免疫荧光和Western blot实验，研究人员证实TBPL1蛋白在T47D、SK-BR-3和MDA-MB-231细胞中过表达，主要定位于细胞质。利用CRISPR/Cas9系统成功敲除TBPL1基因后，RT-PCR显示突变细胞中TBPL1 mRNA完全缺失，Western blot进一步验证蛋白水平显著下降。此外，MTT实验表明TBPL1敲除使健康细胞MCF-12F活力降低75%，T47D、SK-BR-3和MDA-MB-231的活力分别下降37.5%、50%和50%，证明TBPL1是维持细胞生存的关键基因。

健康与乳腺癌细胞系的差异表达分析

RNA-seq数据比较发现，与健康细胞MCF-12F相比，三种乳腺癌细胞系共有3860个基因表达显著改变。PCA分析显示，不同分子分型的细胞系（Luminal A型T47D、HER2过表达型SK-BR-3、三阴性MDA-MB-231）明显分离。KEGG富集分析表明，T47D细胞中核糖体通路基因显著上调，SK-BR-3中PI3K-AKT信号通路和焦点粘连相关基因（如LAMC2、VIM）异常激活，而MDA-MB-231中轴突导向通路和核因子NFATC2表达升高，这些通路与细胞迁移、侵袭和肿瘤形成密切相关。

TBPL1敲除对转录组的特异性影响

对比野生型与TBPL1突变细胞系的转录组发现，基因敲除对不同细胞系的影响具有异质性。健康细胞MCF-12F受影响最显著，流感病毒相关通路和线粒体功能基因表达改变；T47D中人类乳头瘤病毒感染通路基因富集；SK-BR-3中细胞衰老和溶酶体通路激活；MDA-MB-231中免疫应答和谷胱甘肽代谢通路紊乱。此外，研究首次发现多个新型长链非编码RNA（IncRNA）如ESNG00000281383、LINC00460等在突变细胞中异常表达，提示TBPL1可能通过非编码RNA参与转录调控。

讨论与结论

本研究系统揭示了TBPL1在乳腺癌中的双重角色：一方面，其在侵袭性细胞系中过表达并促进肿瘤相关通路（如EMT、细胞迁移）的激活；另一方面，敲除该基因显著抑制细胞活力，表明其可能成为治疗靶点。与既往研究相比，TBPL1在乳腺癌中的调控机制具有细胞类型特异性，例如在MDA-MB-231中通过NFATC2-MMP13轴增强侵袭性，而在SK-BR-3中影响癌症-睾丸抗原（如MAGEA12、CTAG2）表达。此外，新型IncRNAs的发现为理解TBPL1的转录调控网络提供了新方向。

该研究的创新点在于首次将CRISPR/Cas9技术与多组学分析结合，全面解析了TBPL1在乳腺癌中的功能，不仅证实其与患者预后不良相关（如GEPIA2数据库生存分析显示TBPL1高表达组生存率下降至12.5%），还为开发针对TBP家族成员的靶向疗法提供了理论依据。未来研究可进一步探索TBPL1与特定IncRNAs或miRNAs的相互作用，及其在肿瘤微环境中的免疫调节功能。