Daldinia eschscholtzii乙酸乙酯提取物通过调控凋亡与迁移相关基因抑制A549肺癌细胞的抗氧化与抗癌机制研究

《Scientific Reports》：Mycochemistry, antioxidant activity and anticancer potentiality of ethyl acetate extract of Daldinia eschscholtzii against A549 lung cancer cell line

本研究针对现有化疗药物毒副作用强、易产生耐药性等问题，系统评估了子囊菌Daldinia eschscholtzii乙酸乙酯提取物（DEAE）的抗氧化活性及对A549肺癌细胞的抗癌潜力。结果表明，DEAE富含黄酮类、生物碱等28种活性成分，可通过诱导Caspase 3/9、BAX/p53上调及Bcl-2下调促进细胞凋亡，并抑制MMP-2/9表达阻断癌细胞迁移。其核心化合物skimmianine等符合类药五原则，且具抗耐药特性，为肺癌天然疗法开发提供了新候选。

　　

肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。尽管现代医学在化疗、靶向治疗等方面取得了显著进展，但现有化疗药物如顺铂、多柔比星等仍存在诸多局限性：它们往往伴随着严重的毒副作用，如骨髓抑制、肝肾损伤等，严重影响患者的生活质量；更棘手的是，肿瘤细胞容易对药物产生耐药性，导致治疗失败。因此，开发高效、低毒、且能克服耐药性的新型抗癌药物已成为当前研究的迫切需求。

在此背景下，从天然产物中寻找活性先导化合物是药物研发的重要途径。与植物来源的化合物相比，真菌（蘑菇）因其生长周期短、生物活性物质多样且通常副作用较小而展现出独特优势。子囊菌门（Ascomycota）是真菌界中种类最多的类群，其中许多物种已被报道具有抗癌潜力。Daldinia eschscholtzii是一种属于炭角菌科（Xylariaceae）的子囊菌，前期研究表明其粗提物具有一定的抗癌效果，但其针对肺癌的作用及其分子机制尚不明确，特别是对其乙酸乙酯提取物的系统性抗癌研究仍属空白。

为了填补这一知识空白，研究人员在《Scientific Reports》上发表了题为“Mycochemistry, antioxidant activity and anticancer potentiality of ethyl acetate extract of Daldinia eschscholtzii against A549 lung cancer cell line”的研究论文。该研究旨在系统评估Daldinia eschscholtzii乙酸乙酯提取物（DEAE）的化学成分、抗氧化能力及其对A549人非小细胞肺癌细胞的抗癌活性，并深入探讨其作用机制，为开发新型天然抗肺癌药物提供理论依据。

主要技术方法概述

研究采用乙酸乙酯提取野生Daldinia eschscholtzii子实体并冻干成粉（DEAE）。通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）鉴定其化学成分，并测定总酚（TPC）、总黄酮（TFC）等抗氧化成分含量。体外抗氧化活性通过DPPH自由基清除、羟自由基清除、脂质过氧化抑制及FRAP法等评估。抗癌活性采用MTT法检测细胞活力，并通过倒置荧光显微镜观察细胞形态学变化，DAPI染色分析核形态，流式细胞术（Annexin V-FITC/PI染色）定量凋亡率。作用机制层面，利用实时定量PCR（qPCR）检测凋亡相关基因（Caspase 3、Caspase 9、BAX、p53、Bcl-2）及迁移相关基因（MMP-2、MMP-9）的表达水平。此外，通过SwissADME在线工具对DEAE中关键化合物进行了类药性预测。

研究结果

Yield and LC-MS of DEAE

DEAE的提取率为2.84±0.03%。LC-MS分析共鉴定出28种生物活性化合物，包括8种黄酮类化合物（如杨梅酮-3-O-木糖苷、芹菜素等）、3种多酚（如迷迭香酸、槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷等）、8种生物碱（如茵芋碱、石蒜碱二乙酸酯等），以及香豆素、萜类等成分。这表明DEAE是一个富含多种潜在活性分子的复杂混合物。

Determination of total phenolic content (TPC), total flavonoid content (TFC), total tannin content (TTC), and total antioxidant capacity (TAC) of DEAE

DEAE显示出丰富的抗氧化物质含量。其总酚含量（TPC）为56.7±1.3 mg GAE/g，总黄酮含量（TFC）为24.0±0.28 mg QE/g，总单宁含量（TTC）为10.39±0.24 mg TAE/g。总抗氧化能力（TAC）高达110.2±1.3 mg AAE/g，提示DEAE具有强大的整体抗氧化潜力。

Determination of antioxidant activity of DEAE in vitro

体外抗氧化实验证实了DEAE的活性。其对DPPH自由基的半数清除浓度（EC₅₀）为3.55±0.02 mg/mL，对羟自由基的EC₅₀为1.75±0.04 mg/mL，对脂质过氧化的抑制EC₅₀为3.18±0.03 mg/mL，还原力EC₅₀为3.67±0.05 mg/mL。FRAP值为0.990±0.017 mM Fe²⁺/mg。统计学分析（Spearman秩相关检验）显示，TPC、TFC、TTC与DPPH、OH自由基清除能力及脂质过氧化抑制活性呈正相关，表明酚类和黄酮类物质是DEAE抗氧化作用的主要贡献者。

Anticancer activity of DEAE

Cytotoxicity/antiproliferative assay/MTT assay

DEAE对A549肺癌细胞表现出显著的时间和浓度依赖性生长抑制作用。处理24、48和72小时后，其半数抑制浓度（IC₅₀）分别为149.80±0.76、104.60±1.43和87.86±2.29 μg/mL。Tukey多重比较检验表明，不同时间点间的IC₅₀值差异具有统计学意义（p<0.05）。值得注意的是，在高达500 μg/mL的浓度下，DEAE对正常人胚肾细胞（HEK 293T）的抑制作用非常微弱，显示了其对癌细胞的选择性毒性。

Study of cell morphology changes by inverted fluorescence microscope under bright field & Study of nuclear morphology changes under fluorescence microscopy

形态学观察直观地揭示了DEAE的细胞毒性作用。与对照组细胞形态正常、贴壁良好相比，经DEAE处理的A549细胞出现细胞皱缩、变圆、质膜起泡、贴壁能力丧失等现象。DAPI染色显示，随着DEAE浓度增加（50-200 μg/mL），细胞核出现明显的染色质凝集和核碎裂等凋亡特征。

Determination of apoptosis through flow cytometer

流式细胞术定量分析进一步证实了DEAE诱导凋亡的能力。 Annexin V-FITC/PI双染结果显示，对照组晚期凋亡细胞比例为4.6%，而经50、150和200 μg/mL DEAE处理24小时后，晚期凋亡细胞比例分别显著上升至10.9%、34.9%和35.9%。统计分析表明，各处理组与对照组之间的晚期凋亡率差异极显著（p<0.0001），且除150与200 μg/mL组间无显著差异外，其他组间均有显著差异。

Study of gene expression related to apoptosis by qPCR

为阐明凋亡的分子机制，研究人员通过qPCR检测了关键基因的表达。结果显示，与对照组相比，DEAE处理能显著上调促凋亡基因Caspase 3、Caspase 9、BAX和p53的mRNA表达水平，同时下调抗凋亡基因Bcl-2的表达。这种基因表达模式清晰地表明DEAE通过线粒体凋亡通路（内源性通路）诱导了A549细胞的程序性死亡。

Study of gene expression related to anti-migration by qPCR

癌症的迁移和转移是治疗失败的主要原因。本研究还发现DEAE具有显著的抗迁移潜力。qPCR分析显示，DEAE处理能浓度依赖性地显著下调基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的基因表达。这两种酶在降解细胞外基质、促进癌细胞侵袭和转移中发挥关键作用，其表达下调意味着DEAE可能抑制肺癌细胞的迁移和侵袭能力。

Physicochemical, pharmacokinetics, drug likeness, and medicinal chemistry properties of compounds of DEE by the SwissADME predictor

最后，研究通过SwissADME在线工具对DEAE中10个主要化合物进行了类药性评估。结果显示，茵芋碱（skimmianine）、石蒜碱二乙酸酯（lycorine-diacetate）、异紫堇定（isocorydine）、甘草次酸甲酯（glycyrrhetic acid Me ester）等7个化合物符合Lipinski类药五原则（Rule of Five）和Ghose过滤器。尤其重要的是，茵芋碱、甘草次酸甲酯和芹菜素（apigenin）被预测为多种细胞色素P450酶（如CYP1A2、CYP3A4等）的抑制剂，这提示这些化合物可能具有克服肿瘤多药耐药性的潜力，为其进一步开发为抗癌药物增添了价值。

结论与意义

本研究系统阐明了Daldinia eschscholtzii乙酸乙酯提取物（DEAE）作为一种潜在的天然抗肺癌候选物的巨大价值。它不仅具有强大的抗氧化活性，更能通过多靶点作用抑制肺癌细胞增殖：一方面通过激活Caspase级联反应、调控Bcl-2家族蛋白平衡来诱导细胞凋亡；另一方面通过抑制MMP-2/9的表达来阻断癌细胞的迁移侵袭。其富含的多种生物活性成分，特别是那些符合类药性规则且可能抗耐药的化合物，为后续的药物开发奠定了坚实基础。

该研究的发现为从真菌资源中寻找新型抗癌先导化合物提供了有力证据，有望为克服现有化疗药物的局限性提供新的思路和解决方案。未来的研究方向包括分离纯化DEAE中的单体活性化合物进行深入的功能验证，开展动物体内实验评估其安全性和有效性，并进一步探索其与其他抗癌药物的联合应用潜力。