纳米技术对抗超级细菌：生物相容性PCL纳米颗粒通过基因抑制和生物膜干预对抗MDR肺炎克雷伯菌

《Scientific Reports》：Nanotechnology Meets superbugs: biocompatible polymeric nanoparticles combat MDR Klebsiella pneumoniae via gene suppression and biofilm Inhibition

本研究针对碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)治疗难题，开发了聚己内酯(PCL)纳米颗粒负载亚胺培南的新型递送系统。研究表明，该纳米制剂将最小抑菌浓度(MIC)降低8倍，显著抑制生物膜形成，并下调blaOXA-48、blaNDM和blaIMP等关键耐药基因表达。该制剂具有10天缓释特性和高生物相容性，为应对MDR细菌感染提供了有前景的策略。

　　

在医院这个救死扶伤的地方，一个看不见的威胁正在悄然蔓延——医院获得性感染(HAIs)。据世界卫生组织数据显示，发达国家约7%、发展中国家约15%的住院患者会遭受至少一次医院感染，其中约10%的患者因此失去生命。在这场没有硝烟的战争中，革兰阴性肠杆菌科细菌，特别是肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)，已成为医院感染的主要元凶。

更令人担忧的是，这种细菌不仅能够形成坚固的生物膜(biofilm)作为保护屏障，还通过获得抗生素耐药性而进化成"超级细菌"。碳青霉烯类抗生素本是治疗多重耐药革兰阴性菌感染的最后防线，但过度使用导致碳青霉烯酶产生菌株的出现和扩散。碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)感染死亡率惊人，达到30%-70%，被美国疾病控制与预防中心(CDC)列为"紧迫威胁"。

面对这一严峻挑战，传统抗生素研发速度远跟不上细菌耐药性进化步伐。纳米技术为这一困境带来了曙光，它通过靶向递送、提高生物利用度和规避传统耐药机制，为抗感染治疗提供了新思路。在这一背景下，Farnaz Afshar Ebrahimi等研究人员在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果，探索了聚己内酯(PCL)纳米颗粒作为亚胺培南递送载体对抗多重耐药CRKP的潜力。

本研究采用双乳液溶剂蒸发法(w/o/w)制备亚胺培南/西司他丁(IPM)负载的PCL纳米颗粒，通过扫描电镜(SEM)、动态光散射(DLS)和傅里叶变换红外光谱(FTIR)对其进行表征，并评估了药物负载和释放特性。研究使用伊朗卫生部健康参考实验室提供的CRKP临床分离株，通过微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)，时间-杀菌曲线评估杀菌活性，组织培养板法分析生物膜抑制能力，实时荧光定量PCR检测耐药基因表达，MTT法评价细胞毒性。

纳米颗粒形态和表征

扫描电镜分析显示，合成的纳米颗粒呈光滑球形，相对均匀，平均直径为610±125纳米。动态光散射测量证实了SEM结果，显示窄尺寸分布和-18.2±0.8毫伏的zeta电位，表明具有中等胶体稳定性。包封率(EE%)和载药量(DL%)分别为84.5±1.3%和7.79±0.1%，证明双乳液技术成功将亚胺培南封装入PCL纳米球中且损失最小。FTIR光谱证实了药物成功封装，亚胺培南的特征峰(酰胺键C=O伸缩振动在1651厘米^-1和1541厘米^-1)在载药纳米颗粒光谱中明显，表明药物化学结构在制剂过程中得以保留。

体外药物释放曲线、动力学和机制

亚胺培南-西司他丁从聚己内酯纳米球的体外释放曲线呈现双相模式：初始相对突释阶段持续至4天，随后持续释放达10天，累积释放率达53.34%。这种模式表明表面结合药物快速扩散，随后是较慢的基质控制释放。动力学建模显示释放曲线最符合一级动力学模型(R²=0.989)，表明浓度依赖性释放。Higuchi模型(R²=0.984)表明早期相扩散控制，而Korsmeyer-Peppas模型(R²=0.975)表明异常传输，释放指数(n=0.73)反映扩散和聚合物松弛或侵蚀的组合。

纳米颗粒的抗菌活性

最小抑菌浓度(MIC)

游离亚胺培南对碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的MIC为32微克/毫升，而亚胺培南负载纳米颗粒的MIC显著降低至4微克/毫升，降低了8倍。

时间-杀菌曲线

时间-杀菌研究显示，IPM-PCL纳米颗粒处理4小时内细菌数量减少>2-log₁₀，20小时后实现完全细菌清除。相比之下，游离亚胺培南在同一时期内表现出最小的杀菌效果。

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生物膜形成抑制

携带亚胺培南的纳米球在短时间内通过粘附生物膜阻止CRKP分离株生长的能力与游离IPM进行了比较。IPM-PCL纳米颗粒统计上显著减少生物膜生物量65.85%，而游离亚胺培南仅减少25.97%。

分子研究：对耐药基因表达的影响

定量实时PCR显示，IPM-PCL纳米颗粒处理后，bla_OXA-48、bla_IMP和bla_NDM基因显著下调。与未处理对照相比，bla_OXA-48、bla_IMP和bla_NDM的基因表达分别显著降低71%、54%和68%。与游离亚胺培南相比，倍数减少分别为3.57(bla_OXA-48)、2.2(bla_NDM)和3.15(bla_IMP)。

细胞毒性评估(MTT测定)

IPM-PCL制剂在L929正常细胞系中的细胞毒性与未处理组进行比较。MTT测定显示，IPM-PCL纳米颗粒对L929成纤维细胞表现出最小细胞毒性，处理24、48和72小时后细胞活力分别为91%、87%和82%。然而，L929细胞暴露于IPM-PCL纳米颗粒在不同处理时间后未显示细胞活力统计学显著降低。

本研究成功通过双乳液蒸发法制备了亚胺培南封装聚己内酯纳米颗粒。研究表明，与游离亚胺培南相比，PCL纳米球显著增强了亚胺培南对碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌临床分离株的抗菌效果。该制剂还增强了生物膜抑制，并通过下调耐药基因表达(bla_OXA-48、bla_NDM、bla_IMP)对降低CRKP分离株的碳青霉烯耐药性表现出有效作用。此外，合成的纳米颗粒表现出良好的物理化学性质、持续10天的药物释放特性以及在L929成纤维细胞中的优异生物相容性，表明低细胞毒性。

这些发现表明，IPM-PCL纳米球可作为传统抗生素治疗的有前景的替代或辅助手段，用于对抗多重耐药细菌感染。观察到的耐药基因下调是一个特别新颖的发现，虽然精确机制尚待阐明，但研究人员提出一个假设模型：纳米颗粒介导的递送增强了亚胺培南的稳定性和细胞内可用性，这种更高的局部药物浓度可能降低碳青霉烯酶表达的选择优势，从而减弱耐药基因的转录激活。此外，疏水性PCL纳米颗粒与细菌外膜的密切相互作用可能扰动膜稳态并触发全局应激反应，间接影响基因调控通路。

该研究的局限性包括缺乏空白PCL纳米颗粒对照和体内实验数据。未来研究将纳入空白PCL对照，并在相关CRKP感染动物模型中评估该制剂，这对于确认该纳米平台的转化潜力并推动其向临床前和最终临床应用迈进至关重要。