哈萨克斯坦结核分枝杆菌2型北京家族基因组特征与流行病学研究揭示CAO亚系在MDR-TB传播中的主导作用

《Scientific Reports》：Genomic characterization and epidemiology of Mycobacterium tuberculosis lineage 2 isolates from Kazakhstan

本研究针对哈萨克斯坦这一WHO欧洲区MDR-TB高负担国家，通过对177株结核分枝杆菌L2/Beijing家族分离株进行全基因组测序，系统解析了其种群结构和有效种群规模动态。研究发现CAO亚系(L2.2.M4.9.1)为优势流行株(67.2%)，且与高比例MDR(46.9%)和pre-XDR(14.7%)密切相关。研究进一步通过贝叶斯分析揭示Mtb有效种群规模在20世纪90年代末至21世纪初显著增长，与经济危机时期高度重合。该研究为理解MDR-TB在哈萨克斯坦的传播动力学提供了关键基因组学证据。

　　

在结核病(TB)仍然是全球最紧迫的公共卫生威胁之一的背景下，COVID-19大流行进一步扰乱了全球结核病控制工作，导致病例发现减少和未确诊病例激增。全球结核病发病率在2020年至2023年间上升了4.6%，而估计每年发生耐多药结核病(MDR-TB)或利福平耐药结核病(RR-TB)的人数保持不变。哈萨克斯坦被世界卫生组织(WHO)认定为MDR/RR-TB高负担国家，其多数未确诊或治疗无效的MDR-TB患者仍在持续传播感染，这一严峻趋势凸显了针对特定国家的干预措施的必要性。

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)复合体(MTBC)已被分为11个不同的谱系。谱系2(L2)在中亚地区广泛传播，并与高毒力、增加的耐药性和快速传播潜力相关，在俄罗斯、中国和哈萨克斯坦等MDR/RR-TB高负担国家主导着MDR-TB的暴发。在前苏联国家，耐药Mtb克隆的传播被认为是由药物供应中断、治疗方案实施不正确以及感染控制措施不足所驱动，特别是在1990年代的社会经济危机期间。

在此背景下，研究人员对来自哈萨克斯坦15个地区、在2010年至2022年间采集的177株属于L2/Beijing家族的Mtb分离株进行了研究。旨在利用全基因组测序(WGS)和各种计算基因组学流程（包括TB-Profiler、TB-Annotator和MTBseq）以及贝叶斯统计方法，研究Mtb的种群结构和有效种群规模。

关键技术方法

本研究对177株经RT-PCR和/或高通量杂交方法鉴定为L2的Mtb分离株进行了全基因组测序。使用MTBseq等流程将读数映射至Mtb H37Rv参考基因组，进行变异调用和系统发育分析。利用TB-Profiler和TB-Annotator等工具进行基因型耐药性预测和比较基因组学分析。采用BEAST算法进行贝叶斯进化分析，估算进化速率和有效种群规模动态。地理信息系统(QGIS)用于菌株地域分布的可视化。

样本选择与测序

研究包括了从哈萨克斯坦15个地区的结核病患者中收集的Mtb分离株。最终对177株L2分离株进行了全基因组测序，获得了平均97X的测序深度和98.9%的平均基因组覆盖率。

结核分枝杆菌种群结构

WGS基因分型显示，大多数L2分离株属于CAO亚系(L2.2.M4.9.1)(119/177, 67.2%)，其次是亚系L2.2.M4.9(44/177, 24.9%)和欧洲/俄罗斯B0/W148暴发株(L2.2.M4.5)(11/177, 6.2%)。CAO亚系在哈萨克斯坦南部和西部地区（如阿特劳州、阿拉木图州、克孜勒奥尔达州和西哈萨克斯坦州）占主导地位。

基因型耐药性

表型药敏试验显示，样本中耐多药(MDR)分离株(n=83; 46.9%)和预广泛耐药(pre-XDR)分离株(n=26; 14.7%)比例很高。基因型预测显示72.3%的L2分离株为利福平耐药(RR)。rpoB基因RR决定区最常见的突变是S450L(114/128分离株)。与贝达喹啉(BDQ)和氯法齐明(CFZ)相关的耐药性仅发现于阿斯塔纳的Mtb分离株，由Rv0678基因突变驱动。

补偿性突变

CAO亚系在Mtb分离株中表现出最高的利福平耐药流行率(96/119, 80.7%)。其中89.6%的RR CAO分离株(86/96)携带推定的补偿性突变。共检测到63个推定补偿性突变，包括rpoC基因中的33个变异、rpoB基因中的26个变异和rpoA基因中的4个变异。

研究的L2分离株在获得的推定补偿性变异分布上表现出强烈的亚系特异性。rpoA高可能性补偿性变异T187A和G31S仅存在于CAO分离株中。同样，最普遍的rpoC补偿性变异V1039A、V483G/A和L449V也仅在CAO分离株中发现。同塑性分析显示，rpoA T187A和rpoB R552H突变可能为单次起源和克隆扩张，而rpoC V483A/G和V1039A则观察到同塑性出现，表明存在多次独立获得事件和潜在的趋同进化。

系统发育分析

基于3,939个SNP构建的最大似然法系统发育树显示，CAO亚系是一个主要的分支，包含来自所有地区的分离株，表明其在全国范围内的历史和近期持续传播以及克隆扩张。

CAO集群的平均集群内距离为47±25个SNP，表明CAO L2亚系具有当代的结核病出现历史。通过与公共数据库（TB-Annotator v2.5，包含125,000个SRA）的比较分析，发现了六个新的历史集群（L2.2.M4.9.3至L2.2.M4.9.8），它们具有特定的SNP标记，并且集群内距离大于L2.2.M4.9.1系统发育树中描述的距离。

结核分枝杆菌的有效种群规模

贝叶斯天际线分析显示，哈萨克斯坦北京基因型菌株的有效种群规模存在明显波动。最显著的特征是，在1990年代末和21世纪初，Mtb种群的有效种群规模出现了数量级上的增长。

-7次替换。绿色阴影区域表示有效种群规模的变化，显示了95%最高后验密度区间，黑线代表平均值。'>

这一突然激增发生在哈萨克斯坦历史上GDP处于低水平的时期，与1997年能源危机和1998年金融危机时间吻合。

研究结论与意义

基因组学特征揭示，CAO亚系在哈萨克斯坦MDR-TB的流行中非常成功，这一时期恰逢重大的经济波动。观察到的基因组聚类模式表明存在持续的流行病，其特征是单个CAO克隆在哈萨克斯坦多个地区扩张。系统发育分析证实了CAO分离株的单系起源，支持了其广泛的传播和持续的跨区域扩张。推定的补偿性突变，特别是rpoA T187A和rpoC V1039A等，在优势CAO亚系中富集，可能通过减轻利福平耐药相关的适应性代价来增强传播力。

贝叶斯分析揭示的Mtb有效种群规模在1990年代和世纪之交的增长，与苏联解体后的社会经济危机以及1997年能源危机和1998年金融危机等重大经济动荡时期相吻合。这种模式与在俄罗斯观察到的B0/W148克隆的进化动力学相似，凸显了社会经济危机对医疗保健系统的重大影响。此外，如果CAO菌株对一线药物耐药，而未进行适当的药敏试验(DST)的患者接受了标准的一线DOTS治疗，这种选择性压力可能促进了CAO种群（特别是MDR-TB菌株）的扩张。

研究发现超过50%的CAO分离株属于一个大的基因组集群，配对距离低于12个SNP，考虑到样本来自哈萨克斯坦15个地理上不同的地区，这一发现尤为显著。通过大规模比较系统发育分析发现的六个新的历史集群，细化了对L2/Beijing亚支的认识。

然而，研究也存在一定局限性，例如样本收集时间范围较窄可能限制了捕获时间信号的概率，新的基因分型方案和补偿性突变的识别基于相对有限的哈萨克斯坦分离株数据集，需要更大规模、地理更多样的Mtb分离株集合进行验证。

总之，这项研究强调了CAO亚系作为哈萨克斯坦MDR-TB流行的关键驱动因素的作用，其成功与特定的历史社会经济条件密切相关。持续传播而不及时进行药敏试验和个体化治疗可能导致广泛耐药结核病(XDR-TB)病例的增加。研究结果强调了加强基因组监测、及时诊断和个体化治疗对于控制MDR-TB传播的重要性。未来的研究需要结合更长时间跨度的WGS数据和社会网络分析，以更全面地了解结核病在哈萨克斯坦及邻国的传播动力学。